2) MỘT SỐ XĨT NGHIỆM TRONG VIÍM GAN VIRUS 2.1) CÂC XĨT NGHIỆM XÂC ĐỊNH TỔN THƯƠNG GAN
2.3.2.2)CÂC PHƯƠNG PHÂP LAI PHĐN TỬ a) Cơ sở lai phđn tử
a) Cơ sở lai phđn tử
- Nhiệt độ nóng chảy của DNA Tm:Phđn tử DNA sợi kĩp khi được đun lín qua điểm Tm thì sẽ tâch thănh 2 sợi đơn.
- Cơ sở lai axit nucleic: Hai sợi đơn axit nucleic có trình tự bổ sung nhau khi trộn với nhau trong một loại dung môi, đặt ở một nhiệt độ thích hợp sẽ liín kết đặc hiệu. Nhiệt độ lai thường < nhiệt độ nóng chảy của mẫu dò ít nhất 2OC (Tm- probe).
- Hai phđn tử tương tâc đặc hiệu tạo thănh phđn tử lai vă nhờ tín hiệu để phât hiện.
- Lai trong pha lỏng : Câc trình tự bổ sung nằm trong môi trường lỏng. Sự lai phđn tử xảy ra khi câc trình tự năy gặp nhau do chuyển động nhiệt vă nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất văi độ.
- Lai trín pha rắn: Nguyín tắc: Lai trín pha rắn có cùng nguyín tắc với lai trín pha lỏng. Điểm khâc biệt lă trình tự cần tìm được cố định trín một giâ thể rắn. Giâ thể rắn dùng để cố định axit nucleic lă câc măng lai, có 2 loại măng lai:
+ Măng lai bằng nitrocellulose (độ bền cơ học kĩm nín khó thao tâc). + Măng lai bằng nylon (có độ bền cơ học cao, cho phĩp lai nhiều lần). b) Câc phương phâp lai
- Lai Southern blot lă phương phâp lai phđn tử giữa đoạn ADN mẫu dò (probe) được đânh dấu đồng vị phóng xạ hoặc chất phât huỳnh quang với phđn tử ADN cần phât hiện theo nguyín tắc liín kết bổ sung A-T/G-C. Với công nghệ tiín tiến ngăy nay, câc nhf khoa học đê có thể tâch , tinh chế vă xâc định trình tự của DNA HBV. Từ đó thiết kế câc mẫu dò đặc hiệu cùng phương phâp lai Southern có thể xâc định được sự hiện diện của DNA HBV nhờ văo sự bắt cặp bổ sung giữa DNA HBV vă DNA mẫu dò.
Quâ trình lai southern phđn tích sự có mặt của DNA HBV bằng đoạn DNA mẫu dò.
- Phương phâp lai northern: lă phương phâp lai ARN với ADN mẫu dò. ARN được tâch, lăm biến tính trước vă cũng được phđn tâch trín gel agarose có chứa chất lăm biến tính không cho RNA liín kết trở lại cấu trúc bậc 2. ARN được chuyển lín măng lai. ARN cố định trín mang lai được đem lai với DNA mẫu dò có đânh dấu phóng xạ hay huỳnh quanh. Câc phđn tử lai được phât hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi hay huynh quang. Bằng việc xâc định được sự có mặt của câc sản phẩm RNA được phiín mê từ DNA HBV chúng ta có thể xâc định sự có mặt của virus HBV trong cơ thể.
Quâ trình lai Northern phât hiện sản phẩm RNA của quâ trình phiín mê từ DNA HBV.