2) MỘT SỐ XĨT NGHIỆM TRONG VIÍM GAN VIRUS 2.1) CÂC XĨT NGHIỆM XÂC ĐỊNH TỔN THƯƠNG GAN
2.3.2)CÂC XĨT NGHIỆM PHÂT HIỆN NHANH CÂC ĐOẠN ACID NUCLEIC
DNA hoặc RNA có thể được trích từ huyết than, huyết tương, câc bạch cầu đơn nhđn mâu ngoại vi vă câc mô. Câc phương phâp phải đảm bảo DNA có độ tinh sạch cao để phục vụ cho việc phđn tích.
b) Câc đoạn dò
Sử dụng câc đoạn mẫu dò đặc hiệu được tổng hợp nhđn tạo để xâc định sự hiện diện của DNA hoặc RNA của virus trong tế băo. Ngăy nay, vơi sự phât triển hiện đại của khoa học đê phât triển nhiều loại mẫu dò vă câc phương phâp tạo mẫu dò. Có hai loại mẫu dò phổ biến lă: mẫu dò phóng xạ vă mẫu dò phât huỳnh quang.
2.3.2) CÂC XĨT NGHIỆM PHÂT HIỆN NHANH CÂC ĐOẠN ACID NUCLEIC NUCLEIC
2.3.2.1) PCR
Để thực hiện được kỹ thuật giải trình tự chuỗi, chúng ta phải thực hiện 3 bước chính sau: (1) Thực hiện PCR; (2) Thực hiện phản ứng cắt; (3) Điện di vă phđn tích kết quả.
a) THỰC HIỆN PCR.
Để khuếch đại gene của HBV ta dùng kỹ thuật PCR. Mục đích của giai đoạn năy lă khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có ở trong mâu bệnh nhđn: Từ một phđn tử ban đầu thănh hăng tỷ bản sao DNA, từ đó mới thực hiện được giải trình tự chuỗi của HBV. Đđy lă giai đoạn quan trọng, quyết định cho sự thănh công khi thực hiện giải trình tự chuỗi.
Kỹ thuật năy gồm có 4 bước chủ yếu sau đđy (Theo thứ tự từng bước thực hiện):
1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & câch gửi mẫu. 2, Ly trích vă tinh sạch DNA của HBV.
3, Khuếch đại DNA vi rút bằng phản ứng PCR trong mây luđn nhiệt.
4, Kiểm tra & phât hiện sản phẩm khuếch đại (Amplicon) trín gel Agarose. Sau đđy lă chi tiết vă ý nghĩa của mỗi bước thực hiện.
* Lấy mẫu, bảo quản mẫu & câch gửi mẫu. Yíu cầu của mẫu mâu:
1, Serum, plasma (tuyệt đối không dùng Heparin)
2, Tâch serum hoặc plasma trong vòng 4 giờ sau khi lấy mâu
3, Nếu chưa thực hiện ly trích DNA thì mẫu phải được lưu ở –20oC. Nếu gửi mẫu phải giữ mẫu trong đâ khô lă tốt nhất.
4, Trânh hiện tượng phải rả đông mẫu mâu nhiều lần. 5, Mâu tĩnh mạch, lấy lúc đói vă buổi sâng lă tốt nhất
6, Dụng cụ lấy mâu: Vô trùng, loại dùng một lần, thao tâc đúng nguyín tắc vô trùng, có bao tay.
* Ly trích vă tinh sạch DNA của HBV.
Phương phâp ly trích của chúng tôi chọn lă hấp thụ DNA lín câc hạt silica, rửa bằng Ethenol 70%.
* Khuếch đại DNA virus bằng phản ứng PCR trong mây luđn nhiệt. Âp dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction: Phản ứng trùng hợp chuỗi). Đđy lă kỹ thuật khuếch đại một đoạn gen mă chúng ta cần khuếch đại, sau khi khuếch đại chúng ta có một số lượng rất nhiều DNA để ứng dụng văo câc lĩnh vực mă ta quan tđm.
Một chu kỳ của phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn: (1) GIAI ĐOẠN BIẾN TÍNH:
Nhiệt độ của ống mẫu sẽ được tăng lín đến 94o C, ở nhiệt độ năy sẽ lăm cho phđn tử DNA biến tính tâch ra lăm đôi hoăn toăn, tất cả hoạt động của câc men đều dừng lại (Ví dụ hoạt động kĩo dăi ở chu kỳ trước). Mục đích của giai đoạn năy lăm cho phđn tử DNA tâch ra lăm đôi vă được duỗi thẳng ra hoăn toăn, từ đó dễ dăng cho việc bắt cặp vă gắn câc Nu văo mạch đơn đó theo nguyín tắc bổ sung.
Hình minh họa giai đoạn biến tính:
(2) GIAI ĐOẠN BẮT CẶP:
Câc Primer (Câc đoạn mồi) có gắn Biotin lă câc đoạn Nu ngắn (Khoảng 20-25 Nu) có sẵn trong ống mẫu sẽ bắt cặp văo câc chuỗi đơn DNA sau khi biến tính theo nguyín tắc bổ sung. Sự bắt cặp năy sẽ có 2 ý nghĩa đặc hiệu: Đặc hiệu theo nguyín tắc bổ sung với đoạn gen mă ta cần khuếch đại vă đặc hiệu theo chiều dăi của đoạn gen khuếch đại. Ví dụ như ta cần khuếch đại đoạn gene của HBV thì chỉ câc primer cho HBV mới bắt cặp được với câc gen của HBV có trong ống mẫu, còn câc gen của câc loăi khâc sẽ không được bắt cặp (Đồng nghĩa với việc không khuếch đại được).
Hình minh họa giai đoạn bắt cặp
(3) GIAI ĐOẠN KĨO DĂI:
Sau khi primer bắt cặp đặc hiệu với câc mạch đơn DNA, nhờ tâc dụng của men Taq polymerase ở điều kiện thích hợp sẽ gắn câc Nu có sẵn trong ống nghiệm văo câc primer theo nguyín tắc bổ sung, từ đó lăm cho đoạn mồi dăi ra vă hình thănh nín một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Vă một bản sao
DNA mới đê được hình thănh. Như vậy, sau giai đoạn năy ta có được hai phđn tử DNA có cấu trúc giống hệt như phđn tử DNA ban đầu.
Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp vă kĩo dăi thuộc một chu kỳ của khuếch đại DNA. Như vậy, sau mỗi chu kỳ khuếch đại thì từ một phđn tử DNA ban đầu sẽ thănh 2 phđn tử DNA giống hệt nhau, vă sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ có khoảng 230 phđn tử DNA giống hệt nhau (Khoảng 1 tỷ DNA). Như vậy khi số lượng DNA trong mẫu lă văi triệu thì chỉ sau 30 chu kỳ khuếch đại (Thời gian khoảng 2-3 giờ) ta đê có hăng nghìn tỷ bản sao, lượng DNA năy đủ để ta lăm phản ứng cắt cho giải trình tự chuỗi. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình minh họa giai đoạn kĩo dăi
b) Kiểm tra & phât hiện sản phẩm khuếch đại (Amplicon) trín gel Agarose. Sau khi đê thực hiện phản ứng PCR, ta điện di trín gel agarose 2%, mục đích chủ yếu của bước năy lă xem có sản phẩm của PCR không vă đânh giâ kích thước của sản phẩm khuếch đại có đúng lă đoạn dăi như ta đê biết (Có nghĩa lă có bắt cặp của primer vă chiều dăi của amplicon đúng cho HBV).