bằng vi khuẩn Bacillus subtilis và chế phẩm sinh học BT15
Thử nghiệm phòng trừ bệnh HXVK hại khoai tây bằng vi khuẩn đối kháng -
B.subtilis và chế phẩm sinh học BT15 (Bacillus subtilis; Bacillus lichennifomic;
Sacharomyces cerevisiae; Lactobacilus plantarum).
- Khảo sát hiệu lực đối kháng của vi khuẩn B.subtilis trên môi trường nhân tạo. - Khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh của chế phẩm sinh học BT15 trong điều kiện chậu vại. - Khảo sát hiệu quả phòng trừ bệnh của chế phẩm sinh học BT15 ở điều kiện ngoài đồng ruộng. 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn ngoài đồng ruộng
3.5.1.1. Chẩn đoán và nhận biết héo xanh vi khuẩn trên đồng ruộng
- Chẩn đoán nhanh bệnh: Để chẩn đoán nhanh bệnh HXVK, người ta cắt
đoạn gốc thân cây bị bệnh, nhúng vào cốc nước sạch, sau một vài phút nếu thấy dịch trắng sữa chảy ra ở trong cốc và đầu lát cắt, kết luận rằng: mẫu cây bị bệnh HXVK. Quan sát triệu chứng cây héo, khi cắt ngang thân có màu nâu, thâm đen tiến hành cắt đoạn thân cây bệnh dài 3-5cm, đặt trong cốc nước sạch sau vài phút nếu quan sát thấy dịch vi khuẩn màu trắng sữa tiết ra trên đầu vết cắt và trong cốc nước thì đó là do bệnh do vi khuẩn héo xanh R. solanacearum Smith gây ra.
3.5.1.2. Điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây ngoài đồng ruộng
* Điều tra tình hình chung của bệnh HXVK hại trên cây khoai tây tại
Quảng Ninh:
- Điều tra thực trạng bệnh HXVK ngoài đồng ruộng theo phương pháp
điều tra của Cục bảo vệ thực vật (1995), Viện BVTV (1997). Tại các ruộng, các
điểm được chọn, điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 50 cây,
điều tra 3 ruộng, 3 lần nhắc lại, chân đất vàn cao và vàn thấp, mật độ trồng từ 4 củ/m2 đến 6 củ/m2. Dựa vào triệu chứng điển hình của bệnh HXVK trên đồng ruộng đểđánh giá mức độ bị nhiễm bệnh.
- Thời gian điều tra được tiến hành vào vụ đông năm 2014 và vụ xuân năm 2015.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (TLB %): TLB (%) = B A x 100 Trong đó: A: tổng số cây bị bệnh; B: tổng số cây điều tra;
* Điều tra tình hình phát sinh phát triển của bệnh héo xanh vi khuẩn hại
trên cây khoai tây vụ xuân năm 2015 tại Quảng Ninh:
- Phương pháp điều tra:
+) Điều tra theo phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng của của Cục bảo vệ thực vật (1995), Viện BVTV (1997).
+) Các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCB. +) Tiến hành: Chúng tôi tiến hành bố trí trồng và theo dõi tại thị xã Quảng Yên và huyện Bình Liêu trên 2 giống khoai tây Atlantic và giống Solara. Diện tích công thức thí nghiệm là 360m2, nhắc lại 3 lần. Bố trí thí nghiệm theo các công thức, mỗi công thức điều tra cốđịnh 5 điểm trên đường thẳng chéo góc, mỗi
điểm điều tra 50 cây, điều tra định kỳ 7 ngày/ lần. Dựa vào triệu chứng điển hình của bệnh HXVK trên đồng ruộng đểđánh giá tỷ lệ bệnh.
Kỹ thuật trồng trọt được thực hiện theo “Kỹ thuật sản xuất khoai tây” của Cục Trồng trọt năm 2009.
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%).
Bố trí thí nghiệm theo dõi, đánh giá mức độ gây hại của bệnh HXVK trên cây khoai tây thông qua các biện pháp kỹ thuật canh tác như sau:
- Ảnh hưởng của giống đến bệnh HXVK hại khoai tây. Thí nghiệm được bố trí 2 công thức, trên 2 giống khoai tây: +) Công thức 1: Giống Atlantic.
+) Công thức 2: Giống Solara.
- Ảnh hưởng của địa thếđất đến bệnh HXVK hại khoai tây Thí nghiệm được bố trí 3 công thức:
+) Công thức 2: Chân đất vàn. +) Công thức 3: Chân đất vàn cao.
- Ảnh hưởng của mật độ trồng đến bệnh HXVK hại khoai tây Thí nghiệm được bố trí 3 công thức:
+) Công thức 1: Mật độ trồng 4 củ/m2. +) Công thức 2: Mật độ trồng 6 củ/m2. +) Công thức 3: Mật độ trồng 8 củ/m2.
- Ảnh hưởng của chếđộ luân canh đến bệnh HXVK hại khoai tây. Thí nghiệm được bố trí 3 công thức:
+) Công thức 1: Lúa - Lúa - Khoai tây.
+) Công thức 2: Lúa - Rau màu - Khoai tây (Rau màu: rau ăn lá, bí, dưa chuột) +) Công thức 3: Lúa - Lạc - Khoai tây.
- Ảnh hưởng của lượng bón phân đạm urê đến bệnh HXVK hại khoai tây. +) Công thức 1: Phân chuồng 700kg; phân đạm urê 10kg; phân lân super 15kg; phân kali 8kg.
+) Công thức 2: Phân chuồng 700kg; phân đạm urê 12kg; phân lân super 15kg; phân kali 8kg.
+) Công thức 3: Phân chuồng 700kg; phân đạm urê 14kg; phân lân super 15kg; phân kali 8kg.
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.2.1. Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
- Phân lập vi khuẩn: Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một vòng dịch trên bề mặt cắt của thân cây hoặc củ khoai tây đã nhiễm bệnh, sau
đó cấy trên môi trường PSA và PGA. Nuôi trong điều kiện nhiệt độ 280C, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 giờ.
- Môi trường phân ly nuôi cấy vi khuẩn R. solanacearum:
+) Môi trường PSA (Peptone - Sacarose - Agar) (Hayward, A.C, 1960).
Thành phần: Sacarose: 20g; Peptone: 5g;
KH2PO4: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,25g;
+) Môi trường PGA (Potato - Glucose - Agar).
Thành phần: Khoai tây: 200g; Glucose: 20g; Agar: 15g; Nước cất: 1.000ml;
Các ống dịch vi khuẩn này được bảo quản ở 250C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Thành phần môi trường nuôi cấy VKĐK- B.subtilis và chế phẩm BT15:
+) Môi trường thạch thường:
Pepton: 10 g; Cao thịt: 3,0 g; NaCl: 0,5 g; Agar: 20 g; Nước cất: 1.000ml pH: 7. +) Môi trường Hansen:
Pepton: 10 g; Đường kính: 50g; KH2PO4: 2g; MgSO4.7H2O: 2 g; Nước cất: 1.000ml pH: 6,5.
+) Môi trường MRS:
Pepton: 10 g; Cao thịt: 1 g; Đường kính: 20 g; K2HPO4: 2 g; MgSO4.7H2O: 0,58 g; CaCO3: 10g;
Cao nấm men: 5 g; CH3COONa: 5 g; (NH4)3C6H5O7: 2g; Tween: 1 g; Nước cất: 1.000 ml pH: 7;
Các thành phần môi trường nuôi cấy được pha theo công thức như trên, chia vào các ống nghiệm, sau đó được hấp trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1210C; 1,5 atm, trong thời gian 25 phút. Thực hiện thí nghiệm trên đĩa petri môi trường được
đỗ ra đĩa, để nguội.
3.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh học của các mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Nghiên cứu vi khuẩn R. solanacearum trong điều kiện nuôi cấy invitro: Cấy các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường: PSA, PGA đặt trong điều kiện nhiệt độ 280C.
- Nghiên cứu một sốđặc điểm hình thái khuẩn lạc của các mẫu phân lập vi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum.
- Bố trí thí nghiệm : Thí nghiệm gồm 2 công thức, các công thức được thực hiện trên hai môi trường là PSA và PGA, mỗi công thức nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại 3 đĩa pettri.
Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu phân lập vi khuẩn QN41 phân lập từ cây khoai tây trên giống Atlantic tại huyện Bình Liêu và các đĩa Petri chứa các môi trường PSA, PGA hòa vi khuẩn thuần trong nước vô trùng thành dịch (mật
độ tế bào 108 CFU/ml), dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn láng đều lên bề mặt môi trường. Đặt đĩa môi trường đã láng dịch vi khuẩn trong tủ định ôn ở 28°C. Nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện nhiệt độ 28°C.
Quan sát hình thái, số lượng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy.
3.5.2.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi trường nhân tạo
Phương pháp tiến hành: chuẩn bị hộp Petri chứa môi trường PSA (pH=7) với lượng 15ml môi trường/ đĩa petri. Hòa vi khuẩn mẫu phân lập bệnh héo xanh thuần trong nước vô trùng thành dịch (mật độ bào tử 108 CFU/ ml), dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn trang đều lên bề mặt môi trường; dùng giấy lọc hình tròn (đã được hấp vô trùng), đường kính 5mm nhúng vào dịch B. subtilis với mật độ
tế bào 108 CFU/ml đã được pha ở nồng độ 10%, 20%, 30% sau đó đặt vào các
đĩa môi trường. Thí nghiệm được đặt trong tủđịnh ôn ởđiều kiện nuôi 280C. Nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh được sử dụng trong thí nghiệm là mẫu phân lập QN41 được lấy tại Tình Húc - Bình Liêu - Quảng Ninh.
Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức, mỗi công thức 3 đĩa, nhắc lại 3 lần.
- Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn đối kháng B. subtilis, mật độ tế bào 108 CFU/ml được pha ở nồng độ 10%; 20%; 30%.
CT1 (đối chứng): Giấy lọc thấm nước vô trùng. CT2: Giấy lọc thấm B. subtilis 10%.
CT3: Giấy lọc thấm B. subtilis 20%.
CT4: Giấy lọc thấm B. subtilis 30%.
Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính vòng vô khuẩn ở các công thức thí nghiệm sau nuôi cấy 24, 48 và 72 giờ.
3.5.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trong điều kiện chậu vại và ngoài đồng ruộng trong điều kiện chậu vại và ngoài đồng ruộng
3.5.3.1. Phương pháp nghiên cứu tính gây bệnh của mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh
- Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo trên khoai tây (theo quy tắc Koch):
+ Tiến hành trồng củ khoai tây vào các chậu có chứa đất canh tác (đất được hấp ở 1210C; 1,5 atm trong 45 phút), đến khi cây có 3 - 5 lá thật thì tiến hành lây bệnh. Từ nguồn vi khuẩn đã được phân lập, sử dụng để lây bệnh nhân tạo trên khoai tây. Nguồn vi khuẩn được với mật độ bào tử 108cfu/1ml, tiến hành lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp tiêm nách lá (dùng xilanh tiêm vào nách lá thứ 3-4). Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây.
+ Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 7, 14, 21, 28 ngày lây nhiễm.
3.5.3.2. Thí nghiệm khảo sát khả năng phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn trong điều kiện chậu vại tại nhà lưới
Phương pháp tiến hành:
Thí nghiệm được bố trí gồm 4 công thức trên giống khoai tây Atlantic và Solara. Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây (1 củ/chậu nhựa 18cm x 22cm). Củ giống khoai tây được ngâm trong dung dịch chế phẩm sinh học BT15, dung dịch mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum với thời gian là 30 phút (khi củ khoai tây đã nảy mầm). Dung dịch chế phẩm sinh học BT15 và dung dịch mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh được sử dụng ở mật độ tế bào 108 CFU/ml. Giá thể trồng chậu vại là đất tầng canh tác và trấu hun với tỷ lệ 1 : 1
được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C; 1,5 atm trong 45 phút.
- Kỹ thuật trồng trọt theo “Kỹ thuật sản xuất khoai tây” (2009) của Cục Trồng trọt.
+) CT1 (đối chứng): Ngâm củ khoai tây trong 300ml dung dịch mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum – QN41.
+) CT2: Ngâm củ khoai tây vào 300ml dung dịch chế phẩm sinh học BT15, sau khi củ khoai tây nảy mầm lên mặt đất thì tưới 300ml dịch vi khuẩn R.
solanacearum.
+) CT3: Ngâm củ khoai tây đồng thời vào 300ml dung dịch vi khuẩn R.
solanacearum và 300ml dung dịch chế phẩm sinh học BT15, sau đó trồng.
+) CT4: Ngâm củ khoai tây trong 300 ml dung dịch vi khuẩn R.
solanacearum, sau khi củ khoai tây nảy mầm lên mặt đất thì tưới 300ml dịch chế
phẩm sinh học BT15.
Thời gian ngâm củ khoai tây trong các dịch vi khuẩn R. solanacearum và dịch chế phẩm sinh học BT15 là 30 phút, mỗi bình ngâm 10 củ.
Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 7, 14, 21, 28 ngày lây nhiễm.
3.5.3.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây bằng chế phẩm sinh học BT15 trong điều kiện ngoài đồng ruộng
- Thí nghiệm được bố trí trên giống khoai tây Atlantic và Solara ở vụ đông năm 2015 tại Quảng Yên - Quảng Ninh.
- Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh, tiến hành với 3 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, diện tích ô thí nghiệm ở mỗi lần nhắc lại là 8m2 (48 cây). Thí nghiệm sử dụng mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh
R. solanacearum – QN41.
- Kỹ thuật trồng trọt theo “Kỹ thuật sản xuất khoai tây” (2009) của Cục Trồng trọt.
Các công thức được bố trí thí nghiệm như sau:
+) CT1 (đối chứng): Tưới 300ml dịch vi khuẩn R. solanacearum (mật độ tế
bào 108 CFU/ml) cho 1 cây, sau 10 ngày tưới 300ml nước lã.
+) CT2: Tưới 300ml dịch vi khuẩn R. solanacearum cho 1 cây, sau 10 ngày tưới 200ml chế phẩm sinh học BT15 (mật độ tế bào 108 CFU/ml).
+) CT3: Tưới 300ml dịch vi khuẩn R. solanacearum cho 1 cây, sau 10 ngày tưới 300ml chế phẩm sinh học BT15 (mật độ tế bào 108 CFU/ml).
- Thời gian tưới dung dịch vi khuẩn R. solanacearum lây bệnh HXVK là 20 ngày sau trồng (cây khoai tây đã cao 15cm - 20cm).
Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) và hiệu lực phòng trừ
bệnh HXVK (%) của chế phẩm BT15 sau 7, 14 ngày.
- Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm sinh học BT15 trong điều kiện chậu vại và ngoài đồng ruộng được tính theo công thức Abbott.
+) Công thức Abbott:
HLPT (%) = x 100
Trong đó:
HLPT (%): Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm sinh học.
C: số cây chết ở công thức đối chứng (không xử lý chế phẩm). T: số cây chết ở công thức thí nghiệm (có xử lý chế phẩm).
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu
Toàn bộ số liệu được xử lý thống kê sinh học theo phần mềm IRRISTART 4.0 và phần mềm chương trình Excel. Các giá trị trung bình của các nghiệm thức
được so sánh bằng F, t, LSD, Dulcan ở mức xác suất P= 0,95 (α = 0,05). Các chữ
cái a, b, c… được ghi ở các giá trị trung bình có ký hiệu chữ giống nhau thì có giá trị giống nhau về trắc nghiệm Dulcan.
C - T C
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH GÂY HẠI CỦA BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN TRÊN
CÂY KHOAI TÂY TẠI QUẢNG NINH
Bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum Smith) là một trong những loại bệnh gây hại nghiêm trọng trên khoai tây và một số cây trồng cạn khác. Bệnh HXVK đã xuất hiện và gây hại tại nhiều vùng sản xuất nông nghiệp ở
nước ta, bệnh có khả năng thích ứng với nhiều điều kiện khí hậu, sinh thái, thổ
nhưỡng... Bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên khoai tây, bệnh làm thiệt hại về giá trị kinh tế, làm mất phẩm cấp chất lượng khoai tây đặc biệt là bệnh hại củ
giống sẽ dẫn đến ảnh hưởng cả quá trình canh tác, làm mất năng suất, sản lượng và là nguồn bệnh lây lan tiếp cho cây trồng vụ sau.
Đối với Quảng Ninh, là một tỉnh có các ngành công nghiệp và Dịch vụ
- Du lịch phát triển mạnh nên việc đầu tư vào sản xuất nông nghiệp để nâng cao hiệu quả sản xuất được tỉnh quan tâm và có nhiều cơ chế chính sách hỗ trợ để phát triển sản xuất. Cây khoai tây là một trong những cây trồng được tỉnh Quảng Ninh quy hoạch thành vùng sản xuất tập trung và xây dựng mô hình sản xuất hàng hóa tại nhiều huyện, thị nhưng chủ yếu tập trung tại 2 vùng lớn trong tỉnh là: Thị xã Quảng Yên và Huyện Bình Liêu. Hàng năm diện tích trồng của toàn tỉnh khoảng 300 - 350ha trong đó chủ yếu tập trung ở các vùng trồng của thi xã Quảng Yên và huyện Bình Liêu chiếm 80% diện tích. Hiện nay trên địa bàn các vùng trồng khoai tây tại Quảng Ninh bị sâu bệnh gây hại khá nhiều, làm giảm năng suất và mất sản lượng đáng kể. Một trong những bệnh gây hại nghiêm trọng trên cây khoai tây là bệnh HXVK. Tại Quảng Ninh có những năm bệnh HXVK gây hại nặng làm giảm năng suất, sản lượng từ
40% đến 50%, đối với vùng nhân giống có thể bị mất trắng không thu được