3.5.2.1. Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
- Phân lập vi khuẩn: Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một vòng dịch trên bề mặt cắt của thân cây hoặc củ khoai tây đã nhiễm bệnh, sau
đó cấy trên môi trường PSA và PGA. Nuôi trong điều kiện nhiệt độ 280C, theo dõi sự phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 giờ.
- Môi trường phân ly nuôi cấy vi khuẩn R. solanacearum:
+) Môi trường PSA (Peptone - Sacarose - Agar) (Hayward, A.C, 1960).
Thành phần: Sacarose: 20g; Peptone: 5g;
KH2PO4: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,25g;
+) Môi trường PGA (Potato - Glucose - Agar).
Thành phần: Khoai tây: 200g; Glucose: 20g; Agar: 15g; Nước cất: 1.000ml;
Các ống dịch vi khuẩn này được bảo quản ở 250C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Thành phần môi trường nuôi cấy VKĐK- B.subtilis và chế phẩm BT15:
+) Môi trường thạch thường:
Pepton: 10 g; Cao thịt: 3,0 g; NaCl: 0,5 g; Agar: 20 g; Nước cất: 1.000ml pH: 7. +) Môi trường Hansen:
Pepton: 10 g; Đường kính: 50g; KH2PO4: 2g; MgSO4.7H2O: 2 g; Nước cất: 1.000ml pH: 6,5.
+) Môi trường MRS:
Pepton: 10 g; Cao thịt: 1 g; Đường kính: 20 g; K2HPO4: 2 g; MgSO4.7H2O: 0,58 g; CaCO3: 10g;
Cao nấm men: 5 g; CH3COONa: 5 g; (NH4)3C6H5O7: 2g; Tween: 1 g; Nước cất: 1.000 ml pH: 7;
Các thành phần môi trường nuôi cấy được pha theo công thức như trên, chia vào các ống nghiệm, sau đó được hấp trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1210C; 1,5 atm, trong thời gian 25 phút. Thực hiện thí nghiệm trên đĩa petri môi trường được
đỗ ra đĩa, để nguội.
3.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh học của các mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum
Nghiên cứu vi khuẩn R. solanacearum trong điều kiện nuôi cấy invitro: Cấy các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường: PSA, PGA đặt trong điều kiện nhiệt độ 280C.
- Nghiên cứu một sốđặc điểm hình thái khuẩn lạc của các mẫu phân lập vi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R. solanacearum.
- Bố trí thí nghiệm : Thí nghiệm gồm 2 công thức, các công thức được thực hiện trên hai môi trường là PSA và PGA, mỗi công thức nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại 3 đĩa pettri.
Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị mẫu phân lập vi khuẩn QN41 phân lập từ cây khoai tây trên giống Atlantic tại huyện Bình Liêu và các đĩa Petri chứa các môi trường PSA, PGA hòa vi khuẩn thuần trong nước vô trùng thành dịch (mật
độ tế bào 108 CFU/ml), dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn láng đều lên bề mặt môi trường. Đặt đĩa môi trường đã láng dịch vi khuẩn trong tủ định ôn ở 28°C. Nuôi cấy vi khuẩn trong điều kiện nhiệt độ 28°C.
Quan sát hình thái, số lượng, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, đường kính khuẩn lạc sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy.
3.5.2.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi trường nhân tạo
Phương pháp tiến hành: chuẩn bị hộp Petri chứa môi trường PSA (pH=7) với lượng 15ml môi trường/ đĩa petri. Hòa vi khuẩn mẫu phân lập bệnh héo xanh thuần trong nước vô trùng thành dịch (mật độ bào tử 108 CFU/ ml), dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn trang đều lên bề mặt môi trường; dùng giấy lọc hình tròn (đã được hấp vô trùng), đường kính 5mm nhúng vào dịch B. subtilis với mật độ
tế bào 108 CFU/ml đã được pha ở nồng độ 10%, 20%, 30% sau đó đặt vào các
đĩa môi trường. Thí nghiệm được đặt trong tủđịnh ôn ởđiều kiện nuôi 280C. Nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh được sử dụng trong thí nghiệm là mẫu phân lập QN41 được lấy tại Tình Húc - Bình Liêu - Quảng Ninh.
Thí nghiệm được tiến hành với 4 công thức, mỗi công thức 3 đĩa, nhắc lại 3 lần.
- Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn đối kháng B. subtilis, mật độ tế bào 108 CFU/ml được pha ở nồng độ 10%; 20%; 30%.
CT1 (đối chứng): Giấy lọc thấm nước vô trùng. CT2: Giấy lọc thấm B. subtilis 10%.
CT3: Giấy lọc thấm B. subtilis 20%.
CT4: Giấy lọc thấm B. subtilis 30%.
Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính vòng vô khuẩn ở các công thức thí nghiệm sau nuôi cấy 24, 48 và 72 giờ.