2.3.3.1. Phân loại
Họ Potyviridae (tên có nguồn gốc từ Potato vius Y) là họ virus thực vật lớn nhất với trên 200 loài và 6 chi được phân loại trên cơ sở tổ chức bộ gene, vecto lan truyền. Như vậy, cùng với chi Begomovirus (họ Geminivirisdae) Potyvirus là 1 trong 2 chi virus thực vật lớn nhất.
Tất cả thành viên trong họ đều có bộ gen RNA sợi đơn, cực dương, có phân tử dạng sợi mềm đường kính 11-15 nm và dài 650-950 nm đối với các virus có bộ gen đơn và 200-300 x 500-600 nm và dài 650-950 nm đối với các virus có bộ gen kép.
Các virus của 5 chi Potyvirus, Macluravirus, Ipomovirus, Rymovirus và
Tritimovirus có bộ gen không phân đoạn tức bộ gen chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất nên gọi là virus có bộ gen đơn. Các virus của chi còn lại, chi Bymovirus, có bộ gen kép gồm 2 phân tử RNA-1, và RNA-2. Đối với các bymovirus, phân tử RNA-1 tương đương với 2/3 kính thước tính từ đầu 3’ còn phân tử RNA-2 tương đương phần còn lại của bộ gen của các virus có bộ gen đơn. Virus trong họ Potyviridae đa số là có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhưng một số virus lại có phạm vi phổ ký chủ rất rộng, nhiễm cả trên cây 1 lá mầm và 2 lá mầm. Khi nghiên cứu về chi Potyvirus, các tác giả đã thiết kế cặp mồi chung cho chi Potyvirus từ vùng gene CI (là vùng gene có mức độ bảo thủ cao).
2.3.3.2. Đặc điểm phân tử virus (virion)
Hình 2.5. Hình thái phân tử của potyvirus, phân tử PVY
Nguồn: Shukla et al. (1998) Phân tử Potyvirus có hình sợi mềm, kích thước 11-15 x 650-950nm (Dougherty et al., 1989). Mỗi phân tử virion được cấu tạo từ 1700-2000 tiểu
phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn đối xứng xung quanh phân tử RNA genome (Shukla et al., 1998).
2.3.3.3. Cấu trúc bộ gene của chi Potyvirus.
Tất cả các Potyvirus đều có bộ gen là một phân tử ARN sợi đơn, cực dương (+), kích thước ~ 10 kb. Tổ chức bộ gen của các Potyvirus gồm: một vùng 5’ không dịch mã (5’ untranslated region: 5’UTR). Một khung đọc mở (Open Reading Frame: ORF) đơn, lớn gọi là ORF chính (major ORF). Sau khi dịch mã và xử lý thì tạo thành 10 protein chức năng. Một đầu 3’ không dịch mã (3’ untranslated region: 3’UTR), kết thúc bằng 1 đuôi poly-A.
http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html
Hình 2.6. Tổ chức bộ gen của các Potyvirus (Shukla et al., 1998) Bộ gene của chi Potyvirus có một khung đọc mở (Open Reading Frame) (ORF) hay còn gọi là polyprotein, sau dịch mã xử lý thành 10 protein chức năng tính từ đầu 5’-3’ là: protein (P1), Helper component protein (HC-Pro), protein P3, protein 6K1, Cylindrical inclusion (CI), protein 6K2, viral protein genome (VPg), Protein NIa-Pro (major protease of small nuclear inclusion protein NIa), Protein NIb (large nuclear inclusion protein), Protein vỏ (coat protein, CP) (Shukla et al., 1998).
2.3.3.4. Lan truyền
Các virus thuộc chi Potyvirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ rệp muội họ Aphididae theo kiểu không bền vững, một số loài lan truyền thông qua hạt giống và vết thương cơ giới.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Điều tra thành phần bệnh virus hại cà chua tại Hà Nội và phụ cận.
- Các thí nghiệm trong phòng và lây bệnh nhân tạo được tiến hành tại trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ tháng 8 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017.
3.3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Bệnh virus trên cà chua. 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh virus hại cà chua thu thập tại Hà Nội và phụ cận. - Cà Chua (giống Hồng Loan, Sông Hồng 1)
- Ớt (giống AV1, AV10, AV15)
- Thuốc lá cảnh: Nicotiana benthamiana, N. tabacum
- Rau muối: Chenopodium amranticolor.
3.3.3. Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu * Dụng cụ * Dụng cụ
- Trong phòng thí nghiệm: Đĩa petri, bản ELISA, pipet, chày cối sứ, cốc thủy tinh, tủ lạnh…
- Ngoài đồng ruộng: Bút bi, túi đựng mẫu… * Các hóa chất
- Hóa chất cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm, các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm, môi trường.
- Các hóa chất dùng trong RT-PCR, ELISA.
Đệm phủ (Coating buffer, pH 9.6)
- 1.59 g sodium carbonate (Na2CO3) - 2.93 g sodium bicarbonate (NaHCO3) - 0.20 g sodium azide (NaN )
Hòa trong 900 ml H2O, điều chỉnh pH tới 9.6 với HCl và lên thể tích 1 lít.
Đệm PBS (Phosphate Buffer Saline bufer, pH 7.4)
- 8.0 g sodium chloride (NaCl)
- 0.2 g monobasic potassium phosphate (KH2PO4) - 1.15 g dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) - 0.2 g potassium chloride (KCl)
- 0.2 g sodium azide (NaN3)
Hòa trong 900 ml H2O, điều chỉnh pH tới 7.4 với HCl/NaOH và lên thể tích 1 lít.
Đệm PBS-Tween (PBS-T)
- PBS + 0.5 ml Tween 20 /L
Đệm chiết mẫu (Sample extraction buffer, pH 7.4)
- PBST + 2% PVP (Sigma PVP-40 polyvinyl pyrrolidone) + 0.02 M Sodium sulfite (Na2SO3)
Đệm pha kháng thể liên kết (Conjugate buffer)
- PBST + 2% PVP + 0.2% egg albumin (Sigma A-5253)
Đệm cơ chất (Substrate buffer, pH 9.8)
- 97 ml diethanolamine - 600 ml H2O
- 0.2 g sodium azide (NaN3)
Điều chỉnh pH tới 9.8 với HCl và lên thể tích 1 lít
Đệm điện di
Dung dịch đệm TAE 0,5X: pha từ dung dịch mẹ 50X (Tris base 242 g; acid acetic băng 55,1 ml; Na2EDTA 37,2 g; nước cất vừa đủ 1 lít).
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Điều tra bệnh virus trên cây cà chua trên khu vực Hà Nội và phụ cận vụ đông xuân 2016-2017 và xuân hè 2017.
- Kiểm tra ELISA phát hiện virus trên các mẫu thu thập
- Kiểm tra RT-PCR phát hiện virus trên các mẫu thu thập và các mẫu lây nhiễm.
- Lây nhiễm nhân tạo để xác định tính gây bệnh của một số bệnh virus trên cà chua.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp điều tra thành phần bệnh ngoài đồng
- Phương pháp điều tra thành phần bệnh hại cà chua ở ruộng sản xuất: Chọn ngẫu nhiên 1 ruộng đại diện cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây. Điều tra theo phương pháp 10 điểm trên đường chéo góc (cách bờ 2 mét) mỗi điểm điều tra từ 50 - 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn, điều tra 100% số cây đối với ruộng có diện tích nhỏ.
Theo dõi định kỳ, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh. Quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh.
- Phương pháp thu thập mẫu lá bệnh virus:
Mẫu thu đựng riêng trong từng túi có ghi đầy đủ các thông tin sau: + Tên mẫu
+ Địa điểm ruộng; + Thời gian lấy mẫu;
+ Đặc điểm triệu chứng bệnh; + Tỷ lệ nhiễm bệnh chung cả ruộng. - Phương pháp bảo quản mẫu bệnh virus:
Có hai phương pháp bảo quản mẫu: bảo quản khô và bảo quản tươi. + Bảo quản khô: Mẫu thu về được để trong túi chứa hạt Silicagel. Thay hạt Silicagel đến khi mẫu khô.
+ Bảo quản tươi: Mẫu thu về được để nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -200 C ở Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới.
Được tiến hành theo giai đoạn sinh trưởng, chọn những lá có triệu chứng điển hình đem về bảo quản khô bằng hạt Silicagel.
Tính tỉ lệ bệnh theo công thức:
Tỷ lệ bệnh ( % ) = Tổng số cây bị nhiễm bệnh x100 Tổng số cây điều tra
- Phương pháp điều tra mật độ bọ phấn: theo 10 điểm trên 2 đường chéo góc, mỗi điểm 10 lá. Đếm số lượng bọ phấn sống, từ đó quy ra tỷ lệ con/lá.
Tổng số bọ phấn điều tra Mật độ bọ phấn (con/lá) = ———————————
Số lá điều tra
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
3.5.2.1. Phương pháp kiểm tra ELISA (Enzyme linked immune sorbent asay) DAS-ELISA (Double antibody sandwich – ELISA)
Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA gián tiếp dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991) có các bước sau:
1. Cố định IgG. IgG được pha vào đệm Carbonate pH = 9.6. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ở 37oC trong vòng 2-4 giờ. Rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa (rửa mỗi lần 3 phút).
2. Cố định dịch cây. Nghiền mẫu cây trong đệm nghiền mẫu. Tỉ lệ nghiền cho mẫu cây tươi và đệm là 1/10 –1/20, mẫu cây khô là 1/100 – 1/200. Đệm dùng để chiết mẫu là đệm PBS-T- PO . Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 4oC qua đêm. Rửa bản ELISA như bước 1.
3. Cố định IgG-AP. Hòa IgG-AP trong đệm conjugate. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản như bước 1.
4. Đánh giá kết quả. Hòa chất nền NPP (Nitrophenyl Phosphate) trong đệm chất nền. Nhỏ 100 µl/ giếng. Để bản ELISA trong tối và kiểm tra sau 30 phút, 1 giờ. Nếu phản ứng quá chậm, có thể để qua đêm để đánh giá. Đánh giá bằng đo OD ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA. Có thể dừng phản ứng bằng NaOH 3M (nhỏ 50 µl/ giếng).
TAS-ELISA (Triple antibody sandwich –ELISA)
Phương pháp kiểm tra virus bằng TAS-ELISA dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991) có các bước sau:
1. Cố định IgG đa dòng đặc hiệu virus. IgG đa dòng được pha trong đệm carbonate pH = 9.6. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ở 37oC trong vòng 2-4 giờ. Rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa (rửa mỗi lần 3 phút).
2. Khóa bản. Nhỏ100 µl/ giếng dung dịch skim milk 2%. Ủ bản 30 phút ở 37oC. Đổ sạch dịch skim milk (không cần rửa).
3. Cố định dịch cây. Nghiền mẫu cây trong đệm nghiền mẫu. Tỉ lệ nghiền cho mẫu cây tươi và đệm là 1/10 –1/20, mẫu cây khô là 1/100 – 1/200. Đệm dùng để chiết mẫu là đệm PBS-T- PO . Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 4oC qua đêm. Rửa bản ELISA như bước 1.
4. Cố định IgG đơn dòng đặc hiệu virus. Hòa IgG đơn dòng trong đệm conjugate. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản như bước 1.
5. Cố định IgG thứ cấp liên kết AP đặc hiệu kháng thể IgG đơn dòng (RAM- AP). Hòa RAM-AP trong đệm conjugate. Nhỏ 100 µl/ giếng. Ủ bản ELISA ở 37oC trong 2-4 giờ. Rửa bản như bước 1.
6. Đánh giá kết quả. Hòa chất nền NPP (Nitrophenyl Phosphate) trong đệm chất nền. Nhỏ 100 µl/ giếng. Để bản ELISA trong tối và kiểm tra sau 30 phút, 1 giờ. Nếu phản ứng quá chậm, có thể để qua đêm để đánh giá. Đánh giá bằng đo OD ở bước sóng 405 nm bằng máy đọc ELISA. Có thể dừng phản ứng bằng NaOH 3M (nhỏ 50 µl/ giếng).
3.5.2.2. Phương pháp RT-PCR
Chiết RNA tổng số
Chiết bằng kít Tripure
1. Nghiền 0,02g mẫu trong 0,5ml Tripure →Cho vào tube 1.5ml → Ủ dịch chiết 2-15’ ở nhiệt độ 25oC.
2. B sung Chloroform vào tube →Lắc 15 giây →Ủ 2-15’ ở 25oC 3. Ly tâm 15’ →Hút dịch trên cùng sang ống khác
4. Tủa RNA =propanol: Cho propanol vào tube → Ủ 10’ ở 25oC cho RNA kết tủa → Ly tâm 10’ →Bỏ dịch trên tủa, giữ lại RNA
5. Rửa RNA 2 lần bằng Ethanol 75%. Làm khô trong box cấy 30’ 6. Hòa tan RNA trong 20µl TE, bảo quản – 80oC
Phản ứng RT-PCR
* Mồi RT-PCR
thết kế: Tospo-F1/Tospo-R1 (~ 430 bp) và Tospo-F3/Tospo-R3 (~600 bp) để phát hiện tospovirus. Trình tự các mồi là:
Tospo-F1 5’- (TCCATWGCARYRMKYCCYTTAGC)-3’
Tospo-R1 5’- (GAHATGACYTTYMGRAGRCTTGA)-3’
Tospo-F3 5’- (CCCTTGCAIAICTGYTCATADGTDGA)-3’
Tospo-R3 5’- (CCCGTAAACACCATGTCTAMCG)-3’
*Phản ứng RT-PCR: Phản ứng RT-PCR được thực hiện trong cùng một tube phản ứng với thể tích phản ứng 25 µl chứa 12.5 µl hỗn hợp GoTaq Green x2 (chứa sẵn dNTPs, Taq polymerase), 0.5 µl mỗi loại mồi (25 µM), 0.5 µl Reverse Aid reverse transcriptase (Fermentas) và 1µl RNA. Phản ứng được thực hiện theo chu trình sau: tổng hợp cDNA 30 phút ở 50oC, 35 chu trình PCR (94oC /45 giây, 52oC / 45 giây, 72oC / 1 phút).
Điện di agarose *Chuẩn bị
1. Pha đệm điện di TAE 1x từ dung dịch gốc (TAE 5x): lấy 100ml TAE 5x cho vào cốc đong, bổ sung thêm 400 ml nước cất, lắc đều.
2. Chuẩn bị bản gel agarose 1%: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100 ml TAE 1x , cho vào lò vi sóng 2 phút để làm tan agarose. Sau khi agarose đã tan hoàn toàn, bổ sung 2 μl Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng.
3. Khi agarose 1% nằm trong khoảng 55oC thì đổ vào khuôn (chú ý không đổ quá dày cũng không quá mỏng, dày ~ 0.8 cm). Để khuôn ở nhiệt độ phòng 30 phút.
4. Cho vào mỗi ống PCR 3 μl Loading Dye 6X, đảo đều và Spin trong 5 giây.
*Tiến hành
1. Sau 30 phút để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng).
2. Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel ngập sâu khoảng 1mm).
3. Nhỏ mẫu vào giếng. Ngoài các mẫu PCR, cần nhỏ thêm 1 giếng Marker DNA làm chuẩn.
4. Cắm nguồn điện cho máy điện di, đạt hiệu điện thế 100V trong 20 phút. 5. Sau khoảng 25phút, tắt máy điện di, đặt bản agarose lên máy soi gel quan sát các vệt DNA hiện lên và chụp ảnh.
Giải mã và phân tích gen
1. Chạy RT-PCR để nhân đoạn gen mong muốn 2. Thôi gel thu DNA để giải trình tự
3. Kết quả giải trình tự được gửi về kèm file dạng đường kẻ, dạng bộ ba mã hóa
3.5.3. Phương pháp lây nhiễm nhân tạo bằng tiếp xúc cơ học
1. Nghiền lá bệnh bằng chày cối sứ sạch trong đệm phosphate 0.05 – 0.07M, pH 7.0, chứa 0.1% sodium sulfite, 0.2% 2-mercaptoethanol theo tỷ lệ 1 g mô lá/2 ml đệm; lọc qua vải lọc hoặc giấy lọc (chú ý giữ lạnh dịch nghiền trên đá). B sung 1% bột carborandum kích thước 600 mesh vào dịch lọc.
2. Dùng tăm bông tẩm dịch virus và lướt nhẹ trên lá từ cuống đến chót, chú ý không quá mạnh.
3. Rửa ngay lá lây bằng nước. Theo dõi biểu hiện triệu chứng hàng ngày và sau lây 3 đến 4 tuần
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1. ĐIỀU TRA BỆNH VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI HÀ NỘI VÀ PHỤ CẬN Việc xác định bệnh virus trên cà chua dựa theo triệu chứng biểu hiện Việc xác định bệnh virus trên cà chua dựa theo triệu chứng biểu hiện bên ngoài thường rất phức tạp do bệnh thường không biểu hiện triệu chứng đặc trưng. Tuy nhiên, sau khi điều tra thu thập mẫu bệnh virus trên cà chua tại Hà Nội và một số vũng phụ cận, chúng tôi nhận thấy có một số triệu chứng phổ biến. Các triệu chứng này được chúng tôi chia thành 5 loại hình và được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Các hoại hình triệu chứng bệnh virus trên cà chua tại Hà Nội và phụ cận năm 2016-2017
STT Triệu chứng Mô tả Địa điểm
1 Xoăn vàng lá Lá cong, giòn, nhỏ, lá non biến vàng
dữ dội.
Gia Lâm, Đông Anh – Hà Nội; Nam Định; Hải Phòng 2 Khảm lá Lá có vết khảm xanh vàng xen kẽ. Lá bị bệnh thường vàng từ gốc lá, lá hơi cong xuống
Gia Lâm, Đông Anh – Hà Nội; Nam Định; Hải Phòng
3 Lá dương xỉ Lá trên ngọn bị biến dạng, mất thùy,
chỉ còn gân lá dạng dương xỉ. Hải Phòng, Nam Định, Đặng Xá – Gia Lâm 4 Khảm, vàng lá – đốm hình nhẫn – đốm chết hoại Lá vàng, xuất hiện đốm hình nhẫn lá quả, đốm chết hoại thân lá.
Gia Lâm, Đông Anh – Hà Nội; Nam Định; Hải Phòng 5 Biến vàng – tím gân – lùn cây
Lá biến vàng, gân lá tím, cây bị lùn, còi cọc.
Nam Định; Gia Lâm, Đông Anh – Hà Nội
4.1.1. Xoăn vàng lá
Lá cong xuống dưới vào phía bên trong hoặc uốn cong lên phía trên thành hình thuyền, giòn, nhỏ, lá non biến vàng dữ dội, cây lùn còi cọc.
Hình 4.1. Triệu chứng xoăn vàng lá cà chua 4.1.2. Khảm lá
Triệu chứng bệnh có thể xuất hiện trong suốt thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây nhưng triệu chứng đặc trưng từ giai đoạn ra hoa đến thu hoạch quả. Lá mới bị bệnh thường có vết khảm xanh vàng xen kẽ. Lá bị bệnh thường vàng từ gốc lá, lá hơi cong xuống. Quả trên cây bị bệnh thường nhỏ, bị khảm vàng loang lổ hoặc bị biến vàng đôi khi có vết đốm.
4.1.3. Lá dương xỉ
Triệu chứng này thường xuất hiện vào giai đoạn cà chua bắt đầu ra hoa. Cây nhiễm bệnh thường còi cọc. Lá trên ngọn bị biến dạng, mất thùy, chỉ còn gân lá