Để đánh giá ảnh hưởng của giống và thời gian nảy mầm đến chất lượng hạt đậu nành được bố trí thí nghiệm như sau:
+ Giống: 5 giống đậu nành khác nhau - DT2008, DT84, HSB0059- D2,
HSB0058- D4, LSB12-10-2
3.3.2. Thí nghiệm 2
Sau khi thu được kết quả từ thí nghiệm 1, chúng tôi tiến hành lực chọn giống đậu và thời gian nảy mầm cho được kết quả thành phần hóa học GABA và acid phytic tốt nhất để tiến hành làm nghiên cứu ảnh hường của nhiệt độ nước nghiền đến chất lượng sữa chua. Thí nghiệm 2 được bố trí như sau:
- Nhiệt độ nước nghiền (Công thức thí nghiệm) cụ thể:
- Nhiệt độ nước nghiền 80oC: công thức 1 (CT1); - Nhiệt độ nước nghiền 90oC: công thức 2 (CT2); - Nhiệt độ nước nghiền 100oC: công thức 3 (CT3);
- Nhiệt độ nước nghiền: nhiệt độ thường công thức đối chứng;
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn (Slip-plot- design). Mỗi công thức được lặp lại 3 lần.
3.3.3. Thí nghiệm 3
Sau khi thu được kết quả về chất lượng sữa chua (độ nhớt, khả năng giữ nước, cảm quan) tốt nhất từ thí nghiệm 2 chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của mật ong đến tính chất vật lý và cảm quan của sữa chua. Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Tỉ lệ mật ong bổ sung vào sữa chua:
- Tỉ lệ mật ong bổ sung vào sữa chua: 6% (mật ong/sữa chua thành phẩm, theo khối lượng);
- Tỉ lệ mật ong bổ sung vào sữa chua: 9% (mật ong/sữa chua thành phẩm, theo khối lượng);
- Tỉ lệ mật ong bổ sung vào sữa chua: 12% (mật ong/sữa chua thành phẩm, theo khối lượng);
- Tỉ lệ mật ong bổ sung vào sữa chua: 15% (mật ong/sữa chua thành phẩm, theo khối lượng);
+ Tỉ lệ đường bổ sung vào sữa chua: 9% đường kính – Công thức đối chứng. Mỗi công thức được lặp lại 3 lần.
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Phương pháp chuẩn bị hạt và nẩy mầm
Trước khi đem hạt đi ngâm thì cần tiến hành phân loại hạt nhằm loại bỏ những hạt xấu, hạt mốc để tránh ảnh hưởng đến quá trình nảy mầm sau này. Hạt đậu được ngâm trong nước sạch 6 giờ, cho lượng nước ngập trên hạt ít nhất 20 cm. Hạt đủ tiêu chuẩn đem đi ủ là hạt phải no nước, mép hạt hơi sưng, vỏ hạt trong suốt và có thể thấy phôi hạt bên trong qua vỏ. Sau khi nhận thấy hạt đủ tiêu chuẩn, đem đổ nước đi để ráo nước và đem đi ủ. Hạt được trải đều một lớp mỏng trên khay, sau đó cho khay vào tủ ủ hạt ở nhiệt độ 32oC trong thời gian 2 ngày (48 giờ). Trong quá trình ủ cần phải kiểm tra hạt, nếu bề mặt hạt bị nhớt phải lập tức dùng nước rửa sạch nhớt bám vào hạt giống rồi sau đó tiếp tục ủ lại hạt giống, nếu không rửa lại hạt kịp thời thì hạt sẽ không nảy mầm được và sẽ bị thối. Mỗi công thức được lặp lại 3 lần.
3.4.2. Phương pháp sản xuất sữa chua
3.4.2.1 Sản xuất sữa chua đậu nành nẩy mầm
Quy trình sản xuất sữa chua đậu nành nảy mầm được trình bày ở hình 3.1: Sau khi nảy mầm đậu nành ta đem nghiền với nước (tỉ lệ 7/1, nước/đậu) ở nhiệt độ thường, 80oC, 90oC và 100oC, thời gian nghiền 5 phút. Dịch sữa thu được ta đem đi lọc rồi phối trộn sữa bột gầy (3%), bột whey (2%) và đường (9%). Hỗn hợp sữa được đem đi thanh trùng ở 95oC trong 5 phút. Hỗn hợp sữa sau khi thanh trùng ta đem đi đồng hóa bằng Ultra Turax ở 25000 vòng/phút trong 20 giây x 3 lần rồi làm nguội đến nhiệt độ lên men 42oC. Sau khi cấy vi khuẩn, dịch sữa đi lên men trong tủ ấm ở nhiệt độ 42˚C đến pH theo yêu cầu. Kết thúc quá trình lên men sữa được đưa đi bảo quản ở nhiệt độ 4-6˚C trong thời gian 21 ngày. Mỗi công thức được lặp lại 3 lần.
Đậu nành Ngâm Nảy mầm Tách vỏ Rửa sạch Nghiền Dịch sữa Lọc Nước 7:1 Sữa đậu nành 2% sữa whey Phối trộn Thanh trùng (95oC / 5 phút) Đường 9% 3% sữa bột
Hình 3.1. Quy trình sản xuất sữa chua
3.4.2.2. Sản xuất sữa chua đậu nành nẩy mầm mật ong
Quy trình sản xuất sữa chua đậu nành nảy mầm mật ong được trình bày ở hình 3.2: Sau khi nảy mầm đậu nành ta đem nghiền với nước (tỉ lệ 7/1, nước/đậu) ở nhiệt độ 100oC. Dịch sữa thu được ta đem đi lọc rồi phối trộn sữa bột gầy (3%), bột whey (2%) và đường (9%) (mẫu đối chứng). Hỗn hợp sữa được đem đi thanh trùng ở 95oC trong 5 phút. Hỗn hợp sữa sau khi thanh trùng ta đem đi đồng hóa bằng Ultra Turax ở 25000 vòng/phút trong 20 giây x 3 lần rồi làm nguội đến nhiệt độ lên men 42oC. Sau khi cấy vi khuẩn, dịch sữa đi lên men trong tủ ấm ở nhiệt độ 42˚C đến pH theo yêu cầu. Kết thúc quá trình lên men sữa được đưa đi ảo quản ở nhiệt độ 4-6˚C sau 1 ngày rồi phối trộn với mật ong ở các tỷ lệ khác nhau. Sữa chua được bảo quản lạnh trong thời gian 15 ngày.
Đồng hóa Làm nguội ( 42oC) Cấy vi sinh vật Lên men ( 42oC ) Rót hộp Bảo quản lạnh (4oC - 6oC)
Sữa chua đậu nành nảy mầm
Thanh trùng (95oC / 5 phút) Đậu nành Ngâm Đậu nành Tách vỏ Rửa sạch Nghiền Dịch sữa Lọc Nước 7:1 Sữa đậu nành 3% sữa bột 2% bột whey Phối trộn Đường 9%
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất sữa chua đậu nành bổ sung mật ong
Nguyên liệu được chọn lọc trước khi đưa vào sử dụng, loại bỏ những hạt thối, sâu bệnh, nhỏ, loại bỏ rác, vỏ đậu, hạt vỡ. Ngâm hạt đậu trong nước ấm trong 6h, loại bỏ các hạt nổi, thay nước 1h 1 lần để tránh cho hạt không bị lên men, tỷ lệ giữa đậu và nước ngâm là 2/3. Kết thúc ngâm rửa sạch cho đậu vào khay đã lót vải ẩm, dàn đều đậu một mặt trên khay, ủ đậu ở 32oC trong 48h. Ủ xong lấy đậu đã nảy mầm ra và tách bỏ phần vỏ, lưu ý không làm gãy phần mầm đậu tương. Rửa sạch đậu nảy mầm đã bóc hết vỏ, nghiền đậu với nước ở 80oC trong 5 phút, tỷ lệ giữa đậu và nước là 7:1. Sau khi nghiền lọc dịch bằng vải sạch để loại bã. Phối trộn dịch sữa đậu nành với bột gầy, bột whey theo tỷ lệ 3% bột gầy, 2% bột whey, Sữa bột gầy có tác dụng bổ sung protein sữa và tăng chất dinh dưỡng cho dịch sữa, bột whey là protein sữa, giúp đông tụ sữa trong quá trình lên men.
Đồng hóa Làm nguội (42oC) Cấy vi sinh vật Lên men (42oC) Rót hộp Bảo quản lạnh (4oC - 6oC)
Sữa chua đậu nành nảy mầm bổ sung mật ong
Bổ sung mật ong
Thanh trùng dịch sữa ở 95oC trong vòng 5 phút. Cho dịch sữa vào nồi, đun lửa vừa đủ tránh trào sữa, khuấy liên tục và nhẹ nhàng để tránh cháy và tạo bọt. Sau khi thanh trùng, hạ nhiệt xuống 65-70oC, sử dụng máy đồng hóa quay với tốc độ 1600 vòng/phút để làm giảm kích thước các hạt cầu béo, giúp khối dịch ổn định hơn. Chú ý tiệt trùng máy đồng hóa trước khi đồng hóa dịch sữa. Hạ nhiệt độ xuống 42-43oC, cấy men với tỷ lệ 0,003% so với lượng dịch sữa, lưu ý phải hòa tan men vào dịch sữa tránh k đều men. Ủ dịch sữa ở nhiệt độ 41- 43oC từ 6-8h trong điều kiện yếm khí, khi pH đạt 4,3- 4,5 thì kết thúc quá trình lên men. Sau khi kết thúc quá trình lên men đưa khối men về nhiệt độ 22oC để tiến hành rót hộp. Chuẩn bị cốc sạch và lau khô, rót mật ong trước theo tỷ lệ cho trước của các công thức, đối với mẫu đối chứng thì rót luôn dịch men. Sau khi bổ sung dịch men lên trên lớp mật ong, khi rót chú ý không để dịch men hòa lẫn vào sữa chua. Sau khi rót xong dịch men cho ngay vào tủ lạnh, đưa sản phẩm về 4- 6 oC để bảo quản. Tiến hành theo dõi và thực hiện các thí nghiệm kiểm tra các chỉ tiêu và ghi lại kết quả.
3.4.3. Phân tích thành phần hóa học
3.4.3.1. Thành phần hóa học của hạt đậu nành trước và sau nẩy mầm
a. Lấy mẫu và xử lý mẫu
Đối với hạt chưa nẩy mầm: Lấy 100 gram hạt đậu nành sạch, không bẹ lép hoặc sâu mọt. Sau khi tách vỏ, hạt đậu được dùng để phân tích các thành phần hóa học của hạt đậu.
Đối với hạt đậu nẩy mầm: Lấy 100 gram hạt sạch, không bẹ lép hoặc sâu mọt, ngâm trong nước rồi đem đi nẩy mầm. Sau khi nẩy mầm ở các thời gian khác nhau, hạt được tách vỏ để phân tích các thành phần hóa học của hạt đậu nẩy mầm.
b. Xác định hàm lượng chất khô tổng số của hạt đậu nành
Hàm lượng chất khô tổng số của hạt đậu nành được xác định theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4295:2009. Cân khối lượng hạt sau khi tách vỏ cho mẫu vào đĩa đã được sấy khô đến khối lượng không đổi và được xác định khối lượng. Đặt đĩa chứa mẫu vào tủ sấy, sấy mẫu trong 2 h kể từ khi nhiệt độ tủ sấy đạt 105oC ± 2oC. Sau đó dùng kẹp kim loại lấy đĩa chứa mẫu đã đậy nắp ra và để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút. Cân và ghi lại khối lượng đĩa chứa mẫu chính xác đến 1mg. Tiếp tục sấy mẫu khoảng 45 phút, làm nguội, rồi cân lần thứ hai. Nếu sai lệch giá trị giữa hai lần cân vượt quá 1mg thì mẫu phải được sấy thêm cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân không vượt quá 1mg.
Hàm lượng nước X, tính bằng phần trăm khối lượng, theo công thức (1):
Trong đó:
m2: khối lượng đĩa chứa mẫu thử trước khi sấy (g);
m1: khối lượng đĩachén cân chứa mẫu thử sau khi sấy (g); m: khối lượng mẫu cho vào (g).
Hàm lượng chất khô (%) = 100-X
c. Xác định hàm lượng protein của hạt đậu nành
Hàm lượng protein trong hạt đậu nành được xác định bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 8125:2009. Cân khoảng 0.2 g mẫu và 3 – 5 mL H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl rồi để ngâm qua đêm. Đun mẫu trên bếp từ từ cho đến khi sôi thì thêm 4 - 5 giọt xúc tác HClO4 cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu. Chú ý: quá trình vô cơ hóa mẫu trong bình Kjeldahl giải phóng khí SO2 nên phải tiến hành trong tủ hút. Trong quá trình hút nên đặt bình nằm hơi nghiêng trên bếp. Sau đó lấy mẫu ra khỏi bếp và để nguội.
Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, cho mẫu vào bình cất đạm sau đó tráng lại ống Kjeldahl bằng một ít nước cất, cho tiếp vài giọt chỉ thị tashiro (lúc này dung dịch trong bình cất có màu hồng). Sau đó cho khoảng 10 – 15 mL NaOH 30% vào bình cất sao cho dung dịch có màu xanh lá thì đưa ngay vào cất.
Chuẩn bị dung dịch ở bình tam giác để hứng NH3, dùng pipet cho vào bình hứng khoảng 25 mL acid boric, nhỏ vào vài giọt dung dịch chỉ thị tashiro (lúc này dung dịch trong bình hứng có màu hồng). Sau đó lắp vào hệ thống sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch acid boric. Bắt đầu quá trình cất đạm cho đến khi dung dịch trong bình hứng chuyển sang màu xanh lá, để thêm 10 – 15 phút để hứng hết NH3. Lấy bình tam giác ra và đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0.1 N.
Hàm lượng protein tổng số, tính theo % về khối lượng khi chuẩn độ bằng H2SO4 0.1N được tính theo công thức (2)
Trong đó:
5.7: hệ số chuyển đổi của nhóm đậu đỗ;
W: khối lượng mẫu, được biểu thị chính xác tới 0.1 mg (g); V: thể tích H2SO4 0.1N dùng để chuẩn độ (ml).
d. Xác định hàm lượng chất béo hạt đậu nành
Hàm lượng lipid được xác định bằng hệ thống Soxhlet với dung môi là N- hexan. Cân 0.2 - 0.5 g mẫu đã nghiền bằng cân phân tích có độ chính xác 0.001g, cho mẫu vào chén rồi đem đi sấy ở nhiệt độ 105oC trong tủ sấy đến khối lượng không đổi. Gấp túi giấy lọc theo kích thước, đem cân khối lượng giấy lọc rồi đem đi sấy ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi.
Sau đó, cho mẫu vào túi giấy lọc rồi cho vào trong hệ thống Soxhlet để tiến hành trích ly chất béo. Dùng dung môi N- hexan để trích ly, đổ N- hexan sao cho ngập lượng mẫu cho vào. Tiến hành trích ly chất béo trong 3 ngày, sau đó lấy mẫu ra cho vào đĩa petri đem đi sấy ở 105oC, sau 2h lấy mẫu ra cân ghi lại khối lượng. Sau đó tiếp tục đem sấy đến khối lượng không đổi.
Hàm lượng chất béo được xác định theo công thức sau .100
Trong đó:
F: Hàm lượng dầu trong mẫu (%);
C1: Khối lượng gói và mẫu trước khi chiết dầu (g); C2: Khối lượng gói mẫu sau khi chiết dầu (g); C: Khối lượng mẫu (g).
e. Xác định hàm lượng tro
Hàm lượng tro trong hạt đậu nành được xác định bằng phương pháp nung theo (TCVN 8124:2009). Cân 0.2 -1 g mẫu đã được nghiền nhỏ, cho vào chén nung. Cho chén nung vào tủ sấy sấy ở nhiệt độ 105oC khoảng 30- 40 phút, sau đó chuyển chén mẫu vào lò nung. Nung mẫu ở nhiệt độ 6000C trong 10h sau đó cho vào bình hút ẩm để nguội và cân lại chén mẫu.
Trong đó:
Tr: Hàm lượng chất tro (%);
G1: Khối lượng chén nung + mẫu (g); G2: Khối lượng chén nung + tro (g);
G0: Khối lượng chén nung đem phân tích (g).
g. Xác định hàm lượng phytic acid - Chuẩn bị mẫu
Cân 0.5 g mẫu vào ống eppendorf 2 mL, hút 10 mL acid HCl 2.4 % vào mỗi ống. Đem đi lắc 220 vòng/ 16h, sau đó tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vòng ở 10oC trong thời gian 20 phút. Thu lấy dịch trong rồi hút 6 mL dịch trong vào ống fancol thêm 0.5 g NaCl (độ tinh khiết 99.5%), đem đi vontex ở 350 vòng/ 20 phút cho tan hết muối, sau đó đem đi ủ mẫu ở -200C trong 20 phút. Lấy mẫu ra đem đi ly tâm với tốc độ 1000 vòng/ 20 phút ở 100C rồi tách lấy dịch trong. Lấy 1 mL dịch trong pha loãng với 24 mL nước cất, sau đó lấy 3 mL đã pha loãng thêm 1 mL dung dịch wade cho vào ống eppendorf và lắc đều. Đem mẫu đi ly tâm với tốc độ 1000 vòng/ 10 phút ở nhiệt độ 100C, tiến hành đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 500 nm. (Gao, Y; Shang, C; Maroof, M A Saghai; Biyashev, R M;Grabau, E A;Kwanyuen, P;Burton, J W;Buss, G R (2007). A Modified Colorimetric Method for Phytic Acid Analysis in Soybean. Crop Science 47 (5), 1797-1803)
- Chuẩn bị mẫu chuẩn
Hàm lượng phytic acid được xác định thông qua dãy chuẩn phytic acid được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch sodium phytate trong nước cất siêu sạch để đạt được 6 nồng độ phytic acid 0, 5, 10, 20, 40, 80 mg/L. Từ kết quả thu được và đường chuẩn phytic acid tính được hàm lượng phytic trong 1 g chất khô hạt đậu nành và được biểu diễn theo mg/g CK theo công thức sau:
Hàm lượng phytic acid (mg/g CK)
Trong đó
V: thể tích dịch chiết (mL); m: khối lượng mẫu đem chiết;
CK: hàm lượng chất khô trong mẫu (%); C: nồng độ phytic acid tính theo (µg/mL).
h. Xác định hàm lượng GABA
Hàm lượng GABA được xác định bằng hệ thống HPLC Agilent 1260 theo phương pháp của Hayat et al. (2015).
- Xây dựng đường chuẩn GABA + Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Để xác định mối tương quan giữa nồng độ GABA dịch đo và Speak ghi được trên HPLC, nồng độ GABA dịch đo được chuyển hóa từ GABA chuẩn với 6 mức nồng độ khác nhau, cụ thể:
- Dung dịch 1 (dd1): GABA 0.5237 mg/mL: Từ dung dịch gốc GABA có
nồng độ 20.9485 mg/mL. Hút chính xác 200 µL dung dịch chuẩn GABA 20.9485 mg/mL vào ống eppendorf, thêm 1800 µL methanol 50%, thu được dịch chuẩn