5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.3. QUY TRÌNH THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU
Bƣớc 1: Chuẩn bị cấu trúc protein và phối tử
Protein Data Bank (PDB) là một kho lƣu trữ các tọa độ nguyên tử và các thông tin mô tả protein cũng nhƣ các đại phân tử sinh học quan trọng. PDB không ngừng phát triển, phản ánh của những nghiên cứu đang diễn ra trong các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới, cho phép ngƣời dùng có thể truy cập và tải về miễn phí cấu trúc protein từ trang web https://www.rcsb.org/.
liệu về cấu trúc phân tử Pubchem, sau đó tối ƣu hóa hình học bằng phần mềm tính toán lƣợng tử Gaussian 09 ở mức lý thuyết là và PM6.
Bƣớc 2: Chuẩn bị cấu trúc protein và phối tử dƣới dạng file .pdbqt
Cấu trúc protein từ file .pdb đƣợc xử lí bổ sung, chỉnh sửa, loại bỏ phối tử (nếu có) và các phân tử nƣớc, thêm các nguyên tử hydrogen (dùng phần mềm Discovery Studio và AutoDockTools 1.5.6), xác định dạng nguyên tử của các nguyên tố trong phân tử (ứng với mỗi dạng nguyên tử khác nhau, phần mềm sẽ cung cấp tham số trƣờng lực phù hợp) và điện tích sẽ đƣợc tự động thêm vào trong AutoDockTools 1.5.6 và đƣợc ghi lại dƣới dạng file.pdbqt.
Phối tử: Cấu trúc của các phối tử sau khi tối ƣu đƣợc chuyển thành file.pdb nhờ GaussView 05, sau đó thông số của các nguyên tử trong phân tử cũng đƣợc tự động gán cho và ghi lại dƣới dạng file.pdbqt trong AutoDockTools.
Bƣớc 3: Tính AutoGrid
Lƣu file các hợp chất dƣới dạng .gpf bằng cách sử dụng Autogrid trong AutoDockTool 1.5.6. Dùng phần mềm AutoGrid để lấy kết quả. Kết quả đọc đƣợc dƣới dạng file .glg. Xác định không gian khảo sát, khoảng cách trong lƣới điểm.
Bƣớc 4: Docking phân tử
Lƣu các file của các hợp chất dƣới dạng file .dpf bằng Autodock trong AutoDockTool 1.5. Dùng phần mềm AutoDock để thực hiện docking phân tử các phối tử vào tâm hoạt động của protein.
Bƣớc 5: Phân tích kết quả
Tiến hành phân tích kết quả thu đƣợc sau khi docking phân tử. Các khía cạnh cần quan tâm: các giá trị năng lƣợng, hằng số ức chế và tƣơng tác hình thành trong phức protein - phối tử. Việc phân tích các tƣơng tác có thể
sử dụng sự hỗ trợ của phần mềm Discovery Studio Visualizer, PyMol. Từ đó xác định các hợp chất tiềm năng và cấu dạng phù hợp khi phối tử tƣơng tác với thụ thể protein.
Chƣơng 2. TỔNG QUAN VỀ HỆ CHẤT NGHIÊN CỨU 2.1. Giới thiệu về cây Lá đắng
Cây Lá đắng (bitter leaf) còn có tên gọi khác là cây Mật Gấu có tên khoa học là Vernonia amygdalina. Cây Lá đắng đƣợc sử dụng từ rất lâu trong y học dân gian ở một số nƣớc Châu Phi (Nigeria, Cameroon, Zimbawe) và Châu Á, trong đó Đông Nam Á và Nam Á sử dụng phổ biến hơn cả.
Hình 2.1. Hình ảnh của cây Lá đắng (Vernonia amygdalina)
2.1.1. Phân loại khoa học
- Tên khoa học: Vernoniaamygdalina Del. hoặc Vernonia amygdalina (VA)
- Tên tiếng Việt: cây Lá đắng hoặc cây Mật Gấu.
Bảng 2.1. Phân loại khoa học của cây Lá đắng (Vernonia amygdalina)
Giới Plantae
Ngành Angiosperms
Bộ Asterids
Họ Asteraceae
Chi Vernonia
Loài Vernonia
amygdalina
2.1.2. Sự phân bố và đặc điểm sinh thái
Cây Lá đắng có nguồn gốc ở châu Phi. Hiện nay, đang đƣợc trồng nhiều nơi ở cả châu Á và châu Phi. Ở Việt Nam, cây Lá đắng đƣợc trồng chủ yếu ở miền Nam, sau lan rộng ra miền Trung và miền Bắc.
Lá đắng thuộc loại cây thân gỗ, mọc thẳng, tiết diện tròn, cao 1-3m. Khi còn non, thân cành có nhiều long bao phủ bên ngoài, có màu xanh. Khi già không có lông, có màu xám, nốt sần. Lá đơn, mọc so le và không có lá kèm. Cuống lá màu xanh, dài khoảng 1-4 cm. Phiến lá hình trứng hoặc bầu dục, kích thƣớc 3,0-22,0 cm x 1,5-9,5 cm. Gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ. Lông mềm, ngắn và trắng. Hoa lƣỡng tính, màu trắng ngà, mọc ở nách lá hoặc đầu ngọn cành. Tràng hoa phía dƣới dính với nhau tạo thành ống, dài khoảng 5-6 mm, phía trên hơi loe ra và chia thành 5 thùy, hình tam giác, dài khoảng 3 mm. Bộ nhị gồm 5 nhị đều, bộ nhị một bó. Bầu nhụy màu trắng, hình trụ dài khoảng 2-4 mm. Trên đỉnh bầu có đĩa mật hình mâm màu vàng nhạt. Vòi nhụy dạng sợi, màu trắng, dài 8 mm [38]
2.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất trong cây Lá đắng cây Lá đắng
Đã có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về hoạt tính sinh học của cây Lá đắng. Trong đánh giá về hoạt tính sinh học của Vernonia amygdalina năm 2012, Audu và cộng sự đã chỉ ra những hoạt tính sinh học
đáng quý ở cây VA nhƣ: kháng ung thƣ, giảm huyết áp, chống sốt rét, chống đái tháo đƣờng [39].
Năm 2017, trong một báo cáo tổng kết về các tác dụng của cây VA trong y học dân gian, Oyeyemi và các cộng sự đến từ khoa y dƣợc, Đại học Ondo, Nigeria đã cho thấy tác dụng của VA trong quá trình ức chế sự phát triển của giun sán và tiềm năng sử dụng các chiết xuất từ VA để điều trị các bệnh liên quan đến giun sán thay thế các thuốc tổng hợp hiện nay, vì chiết xuất từ cây VA lành tính và ít tác dụng phụ hơn các thuốc trị giun sán trên thị trƣờng hiện nay [40]
Ở Việt Nam, cũng có nhiều nghiên cứu phân lập các thành phần cũng nhƣ công dụng của VA trong điều trị bệnh lí hiện nay. Có thể kể đến nhƣ nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc phân tử của 2 sterol và một flavonoid từ chiết xuất của cây VA trồng ở Thừa Thiên Huế năm 2018 của nhóm nghiên cứu Hoàng Lê Tuấn Anh từ Viện nghiên cứu khoa học miền Trung. Nghiên cứu này cũng đã giới thiệu những hoạt tính sinh học đáng quý của VA, nổi bật trong đó là hoạt tính kháng khuẩn và kháng ung thƣ [41]
Năm 2018, nhóm nghiên cứu gồm các tác giả Nguyễn Thị Chi, Phạm Việt Trang, Lê Xuân Tiến và Nguyễn Văn Thanh thuộc trƣờng đại học Nguyễn Tất Thành đã nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa và ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết từ lá cây Lá đắng. Ức chế enzym α- glucosidase làm giảm tỉ lệ tiêu hóa carbohydrate, ít đƣờng đƣợc tiêu thụ vì carbobydrate không bị phân hủy thành glucose. Ở những bệnh nhân tiểu đƣờng, cao chiết này có tác dụng giảm mức đƣờng huyết [42]
Vì những đặc tính dễ trồng, phân bố nhiều nơi và có các hoạt tính sinh học nổi trội nên cây Lá đắng đang đƣợc các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc quan tâm và là chủ đề của nhiều nghiên cứu có giá trị thực tiễn.
2.2. Các hợp chất thiên nhiên trong cây Lá đắng
Tổng hợp các nghiên cứu thực nghiệm đã đƣợc công bố về thành phần hóa học của cây Lá đắng [39] [43] [44] [45] [46] [47] [48], 23 hợp chất có thành phần tƣơng đối lớn đƣợc tìm thấy trong các bộ phân khác nhau của cây Lá đắng. Tên, công thức phân tử và công thức cấu tạo của 20 hợp chất này đƣợc tổng hợp ở Bảng 2.2. Chúng đƣợc tách thành ba nhóm hợp chất, gồm flavonoid, terpenoid và các hợp chất khác, nhƣ đƣợc trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.2. Danh sách 20 hợp chất thiên nhiên đƣợc tìm thấy trong cây Lá đắng cùng với công thức phân tử (CTPT) và công thức cấu tạo (CTCT) của
chúng
STT Hợp chất CTPT CTCT
1 Luteolin C15H20O6
2 Luteolin7-O-
3 Luteolin-7-O-β - glucuronide C21H20O11 4 Isorhamnetin C16H12O7 5 11,13- Dihydrovernodalin C19H22O7 6 11β,13- Dihydrovernolide C19H24O7 7 Vernolide C19H22O7
8 Vernolepin C15H16O5 9 Vernodalin C19H20O7 10 Vernodalol C19H22O8 11 Hydroxyvernolide C20H24O8 12 Vernomygdin C19H24O7 13 Vernomenin C15H16O5
14 Phytol C20H40O 15 Neoandrographolide C26H42O8 16 Hexadecanoic C16H32O2 17 3,5-bis 1,1-dim ethylethyl phenol C14H22O 18 Tetradecanoic acid C14H28O2 19 9, 12- octadecadienoic acid C18H32O2 20 Cholestane C27H48
Dựa vào đặc điểm cấu trúc, 20 hợp chất trong cây Lá đắng đƣợc phân loại thành 3 nhóm chất: flavonoid, terpenoid và các hợp chất khác; đƣợc thể hiện trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Phân loại các hợp chất thiên nhiên đƣợc tìm thấy trong cây Lá đắng
Nhóm chất Phân loại STT Kí
hiệu Tên thông thƣờng
Flavonoid 1 F-1 Luteolin 2 F-2 Luteolin7-O-glucoside 3 F-3 Luteolin-7-O-β - glucuronide 4 F-4 Isorhamnetin Terpennoid Sesquiterpenoid 5 T-1 11,13- Dihydrovernodalin 6 T-2 11β,13-Dihydrovernolide 11 T-3 Hydroxyvernolide 9 T-4 Vernodalin 10 T-5 Vernodalol 8 T-6 Vernolepin 7 T-7 Vernolide 13 T-8 Vernomenin 12 T-9 Vernomygdin Diterpenoid 15 T-10 Neoandrographolide 14 T-11 Phytol Các hợp chất 17 C-1 3, 5-bis 1,1
khác Dimethylethyl 19 C-2 9, 12-Octadecadienoic acid 20 C-3 Cholestane 16 C-4 Hexadecanoic 18 C-5 Tetradecanoic acid 2.3. Thụ thể EGFR và HER2
EGFR và HER2 là hai thành viên của họ thụ thể Erythroblastic B (ErbB) bao gồm 4 thành viên: ErbB-1 (còn gọi là EGFR hoặc HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3 (HER3) và ErbB-4 (HER4). Cấu trúc của các ErbB tƣơng tự nhau, bao gồm 3 phần [49].
i. Thùy N chủ yếu là các chuỗi β-strand và một chuỗi α-helix. ii. Thùy C gồm các chuỗi α-helix.
iii. Vùng bản lề (hinge region) hay còn gọi là khe liên kết ATP là vùng nối thùy N và thùy C với nhau.
Trong đó, thùy N là nơi tiếp nhận các tín hiệu từ ligand để truyền vào
thùy C nằm bên trong tế bào chất, có vai trò hoạt hóa tyrosine để kích hoạt kinase. Thụ thể tyrosine kinase sẽ đƣợc kích hoạt nếu ATP đƣợc gắn vào vùng bản lề [50]. Việc mất kiểm soát quá trình này, làm cho biểu hiện của EGFR và HER2 biểu hiện quá mức, gây nên những khối u ác tính trong các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ tử cung, ung thƣ dạ dày. Do đó, việc ức chế và cản trở quá trình liên kết ATP với vùng bản lề là chìa khóa mấu chốt để nhắm tới các thụ thể tyrosine kinase khi điều trị ung thƣ do các thụ thể này gây ra [51].
và HER2
Một số loại thuốc tổng hợp đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu này đƣợc trình bày ở Bảng 2.4. Đây là các thuốc tổng hợp đã đƣợc FDA công nhận, cho phép sử dụng trong điều trị các bệnh ung thƣ liên quan đến sự hoạt động quá mức của các thụ thể họ ErbB [52].
Bảng 2.4. Một số loại thuốc tổng hợp đang đƣợc sử dụng trong điều trị các bệnh ung thƣ có liên quan đến các thụ thể EGFR và HER2
Hợp chất (Tên thƣơng
mại)
Công thức phân tử
Loại ung thƣ điều
trị KLPT (amu) Erlotinib (Tarceva) C22H23N3O4 Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ, ung thƣ tuyến tụy
393,4
Lapatinib (Tykerb)
C29H26ClFN4O4S Ung thƣ vú 581,1
Erlotinib (tên thƣơng mại là Tarceva), Lapatinib (tên thƣơng mại là Tykreb) là các phân tử nhỏ đầu tiên đƣợc phê duyệt sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ vú và các u rắn khác. Erlotinib và Lapatinib đều đƣợc xây dựng dựa trên cấu trúc 4-quinazoline [50] và gồm có 3 phần chính nhƣ đƣợc mô tả trong Hình 2.2.
Hình 2.2. Cấu trúc 3 phần cơ bản của thuốc ức chế thiết kế dựa trên khung 4-quinazoline [50].
- Phần đầu kị nƣớc sẽ đi vào túi kị nƣớc đƣợc tạo nên từ thùy N và C của thụ thể, những liên kết kị nƣớc sẽ đƣợc hình thành ở vùng này. Đặc biệt, trên túi kị nƣớc nằm ở thùy N các mạch nhánh có vai trò gác cổng (gatekeeper) tăng tính chọn lọc cho thuốc.
- Phần khung cứng 4-quinazoline liên kết với vùng bản lề bằng liên kết hydrogen.
- Phần đuôi chứa các nhóm chất ƣa nƣớc liên kết với vùng hòa tan thuộc thùy C nằm trong tế bào chất, nhiều liên kết hydrogen đƣợc hình thành ở vùng này, có ý nghĩa dƣợc động học của thuốc.
Mỗi loại thụ thể có hai cấu dạng: hoạt động (active) và không hoạt động (inactive). Hình 2.3 minh họa sự khác nhau giữa hai cấu dạng của một thụ thể. Tùy thuộc vào cấu dạng thụ thể mà thiết kế thuốc ức chế phù hợp, vì thế thuốc nhắm đích đƣợc chia làm hai loại: thuốc ức chế loại I (là thuốc ức chế cấu dạng hoạt động của thụ thể) và thuốc ức chế loại II (là thuốc ức chế cấu dạng không hoạt động của thụ thể). Hình 2.4 minh họa cấu trúc của các cấu dạng có thể có của hai thụ thể EGFR và HER2 đƣợc nghiên cứu
trong luận văn này. Thụ thể EGFR có cả 2 cấu dạng đó [53]. Erlotinib ức chế dạng hoạt động của EGFR (mã PDB: 1M17) nên là thuốc ức chế loại I, còn Lapatinib ức chế dạng không hoạt động của EGFR (mã PDB: 1XKK) nên là chất ức chế loại II. Còn với HER2, Erlotinib và Lapatinib là chất ức chế loại I do ức chế đƣợc với dạng hoạt động của thụ thể (mã PDB: 3PP0). Do đó, khi nghiên cứu về docking phân tử những loại thuốc trên với thụ thể cần lựa chọn đúng mã PDB của protein đích để cho kết quả chính xác [54]
Hình 2.3. Cấu dạng hoạt động (active) và không hoạt động (inactive) của thụ thể [54]
Trên ngân hàng dữ liệu protein (PDB), có nhiều mã protein của hai thụ thể EGFR-TK và HER2-TK đã đƣợc nghiên cứu và công bố. Đối với mỗi mã, cần biết đƣợc cấu dạng nào của thụ thể đang đƣợc mô tả, để lựa chọn thụ thể đích phù hợp trong quá trình docking phân tử. Cấu trúc 3D của các cấu dạng thuộc 2 thụ thể chúng tôi chọn trong nghiên cứu này đƣợc thể hiện trong Hình 2.4
a) Cấu dạng hoạt động của EGFR- TK (mã PDB: 1M17)
b) Cấu dạng không hoạt động của EGFR-TK (mã PDB: 1XKK)
c) Cấu dạng hoạt động của HER2-TK (mã PDB: 3PP0)
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Docking phân tử các phân tử thuốc vào EGFR-TK
3.1.1. Tối ưu hóa các phân tử thuốc
Cấu trúc phân tử của Erlotinib, Lapatinib đƣợc tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu cấu trúc phân tử Pubchem, sau đó đƣợc tối ƣu hóa hình học bằng phƣơng pháp bán kinh nghiệm PM6 sử dụng phần mềm tính toán hóa học lƣợng tử Gaussian 09.
3.1.2. Docking phân tử các phân tử thuốc tổng hợp
Khảo sát tƣơng tác giữa EGFR-TK với các phân tử Erlotinib, Lapatinib. Không gian khảo sát docking phân tử (gridmap) có các thông số nhƣ sau: khoảng cách không gian lƣới điểm là 0,375 Å, kích thƣớc của lƣới điểm là 100 x 100 x 100, toạ độ tâm của lƣới điểm (x ; y ; z) = (12,484; 21,715; 34,076). Phân tử thuốc Lapatinib đƣợc docking phân tử với thụ thể EGFR cấu dạng không hoạt động (mã PDB: 1XKK). Trong khi phân tử thuốc Erlotinib sẽ đƣợc docking với cấu dạng hoạt động của thụ thể EGFR (mã: 1M17). Tiến hành tìm kiếm ngẫu nhiên 50 phức có năng lƣợng liên kết thấp nhất giữa phối tử và protein bằng phƣơng pháp Lamarckian GA, chọn ra phức có năng lƣợng liên kết âm gần với thuốc so sánh để phân tích. Những phối tử có năng lƣợng liên kết khác xa so với thuốc so sánh sẽ đƣợc chạy lại với số lần tìm kiếm ngẫu nhiên là 100 rồi chọn ra phức có năng lƣợng liên kết âm nhất để phân tích. Kết quả thu đƣợc trong Bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả docking phân tử các phân tử thuốc tổng hợp với thụ thể EGFR-TK Phân tử Mã PDB của thụ thể Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) Erlotinib 1M17 -7,76 -10,74 2,98 Lapatinib 1XKK -12,59 -15.87 3,28
3.1.3. Tương tác với các phân tử thuốc tổng hợp
Tiến hành phân tích chi tiết liên kết trong phức có năng lƣợng liên kết thấp nhất trong 50 phức giữa phân tử thuốc tổng hợp với EGFR-TK.
Tương tác của Lapatinib với thụ thể EGFR-TK
Hình 3.1 cho thấy vòng quinazoline của Lapatinib tạo liên kết hydrogen dạng N-HN có độ dài 2,29 Å với Met793, một amino acid ở khu vực bản lề, nơi gắn kết ATP. Lapatinib còn tạo các tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid: Leu718, Val726, Ala743, Lys745, Met766, Leu788 và Leu844 cho thấy Lapatinib có phần đuôi kéo dài vào túi kị nƣớc, nơi chứa ATP. Bên cạnh đó, việc hình thành liên kết hydrogen với Cys797, một amino acid nằm ở thùy C của kinase. Liên kết này cho thấy Lapatinib đã