7. Đ ÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
2.3.2. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền các mẫu
giống nghiên cứu
2.3.2.1. Phương pháp phân tích đa dạng hình thái – nông học các giống khoai môn sọ và một số loài có quan hệ gần
Các đặc điểm hình thái – nông học được mô tả, đánh giá theo biểu mẫu giống IPGRI [48] và phương pháp của Singh (2008) [99].
- Các chỉ tiêu hình thái – nông học: 20 chỉ tiêu gồm 11 đặc điểm hình thái (chiều cao cây, hình dạng lá, dạng mép lá, màu sắc phiến lá, màu sắc rốn lá, màu sắc cuống lá…), 9 đặc điểm nông học (hình dạng củ, khối lượng củ, màu sắc thịt củ, mùi thơm của củ khi nấu chín…) đã được đánh giá.
- Thời điểm theo dõi, đánh giá: Đặc điểm của các bộ phận trên mặt đất như các đặc điểm hình thái của lá, bẹ lá ... được theo dõi, đo đếm sau khi trồng 5 tháng. Đặc điểm của các bộ phận dưới mặt đất như các đặc điểm của củ, dải bò ... được theo dõi, đo đếm sau khi trồng 6 - 7 tháng và sau khi thu hoạch.
- Xử lý số liệu: số liệu về các tính trạng hình thái – nông học của các giống nghiên cứu được sử dụng để phân nhóm theo các đặc điểm hình thái – nông học dựa trên hệ số khoảng cách Euclidean và phân tích UPGMA (Sokal and Michener, 1958) sử dụng phần mềm NTSYSpc version 2.11x.
2.3.2.2. Phương pháp tách chiết và kiểm tra chất lượng ADN
* ADN tổng số được tách chiết từ các lá non của những cây sinh trưởng và phát triển tốt, không bị bệnh theo phương pháp CTAB của P. Obara-Okeyo và Kako (1998) [83].
* Kiểm tra chất lượng ADN được tách chiết từ các mẫu giống bằng đo quang phổ kế và điện di:
- Phương pháp đo quang phổ kế [6]:
Nguyên tắc của phương pháp do quang phổ kế là dựa vào sự hấp thu mạnh tia tử ngoại ở bước sóng 260nm của base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm (OD260nm) của các mẫu giống cho phép xác định nồng độ axit nucleic trong mẫu giống. Đơn vị OD260nm tương ứng với nồng độ 50ng/ml cho một dung dịch ADN sợi đôi. Do đó nồng độ ADN trong mẫu giống được tính theo công thức: CADN = OD260nm * 50 * Độ pha loãng.
Kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch axit nucleic bằng xác định tỉ số OD260nm/OD280nm. Dung dịch axit nucleic được xem là sạch (không lẫn tạp) khi tỉ số này nằm trong khoảng 1,8 – 2.
- Phương pháp điện di (6):
Sau khi tách chiết, ADN được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, nhuộm trong Ethilium bromide nồng độ 10mg/ml trong 15 phút. Quan sát và phân tích các vệt băng bằng đèn UV. ADN tách chiết không bị đứt gãy và đủ sạch thì các băng ADN sẽ sáng ngọn và rõ nét.
2.3.2.3. Phương pháp phân tích đa dạng di truyền các mẫu giống sử dụng chỉ thị RAPD
Phản ứng PCR được tiến hành theo phương pháp của Williams & cs (1990) [107]. Hỗn hợp 15 μl dung dịch phản ứng PCR- RAPD chứa 1 μl ADN khuôn (20 ng/μl), 1 μl đệm PCR (10X), 1 μl MgCl2 (25mM/μl), 1,5 μl mồi (10 pM/μl), 0,6 μl dNTP (10mM/μl), 0,2 μl Taq- polymerase (5U/μl) và 9,2 μl H2O. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR - RAPD: 940C (5 phút), 40 chu kỳ [900C (30 giây); 350C (1 phút 30 giây); 710C (1 phút 45 giây)] và kết thúc ở 720C (7 phút).
Sản phẩm phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím.
2.3.2.4. Phân tích đa dạng di truyền các mẫu giống sử dụng chỉ thị SSR
Phản ứng PCR - SSR được tiến hành theo phương pháp của Singh (2008) [99]. Hỗn hợp 10 μl dung dich phản ứng chứa 1 μl ADN khuôn (10 ng/μl), 1 μl đệm PCR (10X), 1 μl MgCl2 (25 mM/μl), 1 μl mồi xuôi (10 pM/μl), 1 μl mồi ngược (10 pM/μl), 1 μl dNTP mỗi loại (10mM/μl), 0,8 μl Taq-polymerase (1U/μl) và 3,2 μl H2O. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR - SSR: 940C (5 phút), 35 chu kỳ [940C (1 phút); 560C (45 giây); 720C (1 phút)] và kết thúc ở 720C (7 phút). Sản phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide 12% trong môi trường đệm TBE 10X ở 100W trong 2 giờ 10 phút. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide và quan sát dưới đèn cực tím.
2.3.2.5. Phương pháp lựa chọn bộ mẫu giống hạt nhân khoai môn sọ
Lựa chọn bộ mẫu giống hạt nhân đại diện cho các mẫu giống khoai môn sọ nghiên cứu dựa theo phương pháp của Mace và cs (2010) [71] có cải tiến phù hợp với đặc điểm bộ mẫu giống thu thập và kết quả đánh giá đa dạng di truyền:
Lựa chọn bộ mẫu giống ban đầu gồm 60% (24 mẫu giống) các mẫu giống khoai môn sọ sử dụng trong nghiên cứu dựa trên kết quả phân nhóm sử dụng chỉ thị RAPD và các đặc điểm hình thái nông học, có chú ý đến phẩm chất của củ cho tiêu dùng. Từ 24 mẫu giống trong bộ mẫu giống ban đầu, lựa chọn bộ mẫu giống hạt nhân gồm 30% (12 mẫu giống) các mẫu giống trong nghiên cứu dựa trên chỉ thị SSR (hệ số tương đồng di truyền và các alen đặc trưng mẫu giống, đặc trưng vùng sinh thái).
2.3.3. Phương pháp phân tích thành phần dinh dưỡng củ của một số giống khoai môn sọ
Phân tích thành phần dinh dưỡng củ khoai môn sọ được tiến hành theo phương pháp đề xuất cho cây khoai môn sọ của Aregheore (2003) [34]:
- Thu mẫu giống và chuẩn bị:
Củ của 12 giống khoai môn sọ trong bộ sưu tập hạt nhân được phân tích các chỉ tiêu dinh dưỡng: hàm lượng chất khô, khoáng đa lượng, khoáng vi lượng và
đánh giá vị ngon. Các củ tươi được gọt sạch vỏ, nấu chín, cắt thành miếng nhỏ chuẩn bị cho phân tích.
- Phương pháp phân tích:
Hàm lượng chất khô được xác định bằng sấy khô củ nấu chín ở 102oC trong 24 giờ [34].
Hàm lượng protein thô xác định theo phương pháp Kjeldahl (Nx6,25) [101]. Các chỉ tiêu khoáng đa lượng, vi lượng được xác định bằng máy quang phổ hấp phụ nguyên tử [34].
- Độ ngon của củ được đánh giá dựa theo phương pháp đánh giá của Aregheore và cs (2003) [34].
Một số tính trạng cảm quan, mùi thơm và vị ngon của củ khoai môn sọ được đánh giá theo mức độ ưa thích của người sử dụng. Lấy ý kiến của 15 – 20 người sau khi ăn củ khoai môn sọ nấu chín để đánh giá độ ngon của củ cho mỗi giống.
Điểm đánh giá của cá nhân người ăn cho mỗi giống dựa vào mức độ thơm ngon, yêu thích của người kiểm tra theo thang điểm sau:
Củ không ăn được (ngứa): 0 điểm
Chất lượng kém (hơi ngứa, sượng): 1 điểm Chấp nhận được (không ngứa, bở): 2 điểm Ngon (không ngứa, bở, dẻo): 3 điểm
Rất ngon (không ngứa, bở, dẻo, thơm nhẹ, ngọt): 4 điểm
Đặc biệt thơm ngon (không ngứa, rất bở, rất dẻo, thơm hoặc rất thơm, ngọt): 5 điểm.
(Vị ngon được sắp xếp theo điểm tăng dần từ không sử dụng củ để ăn đến vị ngon đặc biệt dựa vào độ bở, dẻo, vị ngọt, mùi thơm của củ khi nấu chín).
Điểm tổng hợp trung bình để xếp nhóm theo độ thơm ngon của củ giống như sau:
Chất lượng kém: < 2 điểm Chấp nhận được: 2 – 2,9 điểm Ngon: 3 – 3,9 điểm
Rất ngon: 4 – 4,9 điểm Đặc biệt thơm ngon: 5 điểm