7. Đ ÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
3.2.2. Nghiên cứu tạo củ in vitro và tiềm năng ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro
trong sản xuất
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thành công nhân giống in vitro ở mục 3.2.1, chúng tôi lựa chọn 2 giống cho nghiên cứu tạo củ in vitro là giống Môn thơm (Lạng Sơn) và giống Sáp vàng (Thanh Hóa).
3.2.2.1. Cảm ứng sự tạo củ in vitro
* Ảnh hưởng của BAP và đường (saccharose) đến thời gian hình thành củ
Các chồi in vitro đạt kích thước 3 - 5cm được đưa vào môi trường MS không bổ sung chất kích thích sinh trưởng sau 3 tuần được cấy vào môi trường cảm ứng
tạo củ. Môi trường cảm ứng tạo củ in vitro được sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS có bổ sung đường (saccharose) và các chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ khác nhau (Bảng 3.21). Các kết quả thí nghiệm cho thấy cây bị ức chế sinh trưởng và chết khi môi trường có bổ sung BAP ≥ 7mg/l hoặc đường ≥ 9% ở tất cả các công thức thí nghiệm.
100% chồi hình thành củ khi môi trường nuôi cấy có bổ sung 1mg/l BAP hoặc 5 mg/l BAP và trong khoảng từ 5% - 6% đường. Tuy nhiên, các chồi sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung nồng độ đường 3% (nồng độ cơ bản dùng trong nuôi cấy mô) và 1 mg/l BAP, tuy cần thời gian nuôi cấy dài hơn (6 - 12 tuần), các chồi cũng tự tích lũy chất dinh dưỡng và hình thành củ.
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của BAP và đường đến tỉ lệ (%) chồi hình thành củ ở 2 giống khoai môn sọ sau 8 tuần nuôi cấy
Đường (%)
Tỉ lệ chồi hình thành củ (%)
0 BAP (mg/l) 1 BAP (mg/l) 5 BAP (mg/l)
Môn thơm Sáp vàng Môn thơm Sáp vàng Môn thơm Sáp vàng
0 Cây chết Cây chết Cây chết
3 Cây phát triển xanh, gày,
không hình thành củ
30 32 0 0
4 72 75 60 68
5 Cây không phát triển 100 100 100 100
6 Cây chết 100 100 100 100 7 68 70 28 28 8 50 51 Cây chết 9 Cây chết
* Ảnh hưởng của BAP và nồng độ đường đến tỉ lệ số chồi hình thành củ/cụm chồi (tỉ lệ nhân củ in vitro) sau 8 tuần nuôi cấy
Các củ in vitro được thu hoạch ở thời điểm 4, 6, 8 tuần sau khi cấy trên môi trường tạo củ. Sau 8 tuần, tỉ lệ nhân chồi củ của các giống đạt được khá cao từ 4 - 7 củ/cụm chồi củ. Đặc biệt, tỉ lệ nhân củ cao khi sử dụng môi trường nuôi cấy có bổ sung 5mg/l BAP và 5% - 6% đường (Bảng 3.22). Ở môi trường có bổ sung 3%
đường, 1mg/l BAP sau 8 - 12 tuần nuôi cấy, cây cũng tự tích lũy và hình thành củ, trung bình 2 - 3 củ/cụm chồi.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của BAP và đường đến hệ số nhân chồi củ (số chồi củ/cụm) ở hai giống khoai môn sọ sau 8 tuần nuôi cấy
Đường (%)
Tỉ lệ nhân chồi (Số chồi củ/cụm)
1 BAP (mg/l) 5 BAP (mg/l) Thơm Sáp vàng Thơm Sáp vàng 3 1 – 2 2 - 3 0 0 4 2 – 3 2 - 3 3 – 4 4 - 5 5 5 – 6 5 - 6 6 – 7 7 - 8 6 5 – 6 5 - 6 6 – 7 7 - 8 7 3 – 4 3 - 4 4 – 5 4 - 5 8 3 – 4 3 - 4 Cây chết Cây chết
* Ảnh hưởng của BAP và nồng độ đường đến khối lượng củ tươi thu hoạch sau 8 tuần nuôi cấy.
Các củ thu hoạch sau 8 tuần nuôi cấy được cân và phân nhóm theo khối lượng củ (Bảng 3.23, Hình 3.16). Môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP có khối lượng củ tươi cao hơn của củ tạo được trong môi trường MS bổ sung 5mg/l BAP.
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của BAP và đường đến khối lượng củ tươi của một số giống khoai môn sọ sau 8 tuần nuôi cấy
Đường (%)
1 mg BAP/l 5mg BAP/l
Môn thơm Sáp vàng Môn thơm Sáp vàng
A b a b a b a b 3 0,24 0,21 0,22 0,2 4 1,0 0,23 1,0 0,25 0,23 0,22 0,26 0,24 5 0,29 0,26 0,28 0,25 0,26 0,25 0,28 0,25 6 0,29 0,25 0,28 0,24 0,28 0,25 0,29 0,25 7 0,35 0,27 0,32 0,30 0,28 0,24 0,3 0,25 8 0,35 0,28 0,35 0,30
Ghi chú: a- Khối lượng củ tươi lớn nhất (g);
Hình 3.16. Củ in vitro được tạo ra
trong môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP và 5% đường
3.2.2.2. Sinh trưởng của cây mọc từ củ in vitro
Củ in vitro có khối lượng lớn hơn hoặc bằng 0,2g được thu hoạch và bảo quản trong lọ thủy tinh kín, ở nhiệt độ 40C – 100C của tủ lạnh từ 3 và 6 tháng đã được đem trồng ngoài đồng ruộng (Hình 3.17). Tỉ lệ nảy mầm của củ in vitro thành cây đạt 99 - 100% ở cả 2 giống.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
Cây in vitro của 2 giống Môn thơm (Lạng Sơn) và Sáp vàng (Thanh Hóa) đều không tạo củ in vitro trên môi trường MS không bổ sung BAP nhưng lại có cảm ứng tạo củ trên môi trường có bổ sung 3% - 8% đường và 1 – 5 mg/l BAP. Tuy nhiên, tất cả các chồi in vitro (100%) của 2 giống khoai sọ nghiên cứu đều tạo củ in vitro khi được nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản có bổ sung 1 - 5mg/l BAP, 4% - 6% đường.
Môi trường MS bổ sung 4% đường và 1mg/l BAP cho khối lượng củ tươi lớn hơn. Tỉ lệ nhân chồi lớn nhất khi sử dụng môi trường MS bổ sung 6% đường và 5mg BAP.
Các củ in vitro có khối lượng ≥ 0,2g bảo quản ở nhiệt độ 40C sau 3 hoặc 6 tháng đều nảy mầm thành cây con (đạt 99%) và biểu hiện sinh trưởng tốt trong điều kiện nhà lưới.
Không phát hiện thấy sự khác biệt có ý nghĩa về sự sinh trưởng chiều cao cây cũng như năng suất của cây trồng từ củ in vitro và từ củ con theo phương pháp truyền thống.
Nhân giống khoai môn sọ từ củ in vitro đơn giản hơn, tỉ lệ cây con sống sót cao hơn so với nhân giống từ cây in vitro. Kết quả nghiên cứu mở ra tiềm năng ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong nhân giống phục vụ bảo tồn và sản xuất.
A – Mầm cây 1 – 2 tuần tuổi
Môn thơm (Lạng Sơn) Sáp vàng (Thanh Hóa) B – Cây khoai sau 5 tháng trên đồng ruộng
Cây trồng từ củ giống theo phương pháp truyền thống (ảnh 1), cây trồng từ củ in vitro (ảnh 2).
Hình 3.17. Cây khoai môn sọ mọc từ củ in vitro phát triển trên đồng ruộng
Môn Thơm (Lạng Sơn) Sáp vàng (Thanh Hóa)
A A
2
3.2.3. Thử nghiệm ứng dụng kết hợp đột biến phóng xạ tia gamma (nguồn Co60)và nuôi cây mô, tế bào thực vật ở khoai môn sọ
Ba giống khoai: Ce19 - Cụ Cang (Sơn La), Ce4 - Môn thơm (Lạng Sơn) và Ce32 - Sáp vàng (Thanh Hóa) đã được chọn xử lí tia gamma (nguồn Co60) vào giai đoạn chồi in vitro để nghiên cứu mức độ mẫn cảm với phóng xạ gamma và liều chiếu hiệu quả tạo vật liệu khởi đầu phục vụ cải tiến giống khoai môn sọ địa phương. Thí nghiệm thăm dò ban đầu cho thấy, khi xử lí chồi in vitro của cả 3 giống trong khoảng liều chiếu xạ từ 5 gray (Gy) đến 100 Gy, ở liều chiếu 5 (Gy) không nhận thấy có sự khác biệt về khả năng sống sót, sinh trưởng, phát triển và hình thái của chồi so với đối chứng sau 4 tuần theo dõi; ở liều chiếu từ 95 Gy trở lên tất cả chồi in vitro của cả 3 giống đều không có khả năng sống sót ngay sau tuần đầu tiên; các liều chiếu xạ trong khoảng 10 – 90 Gy, các chồi in vitro có biểu hiện sai khác với đối chứng về cả khả năng sống sót, sinh trưởng, phát triển và hình thái ở cả 3 giống khoai môn sọ. Vì vậy, chúng tôi đã xác định khoảng liều chiếu cho nghiên cứu mức độ mẫn cảm với phóng xạ gamma của chồi in vitro của 3 giống khoai môn sọ nghiên cứu là từ 10 - 90 Gy.
3.2.3.1. Khả năng sống sót của chồi in vitro sau xử lí chiếu xạ tia gamma
Tổng số 300 chồi in vitro của mỗi giống đã được xử lí tia gamma ở khoảng liều chiếu từ 10 – 90 Gy. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần độc lập. Tỷ lệ sống sót của chồi sau 1, 2, 3, 4 tuần được theo dõi, thống kê và phân tích. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.24.
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của các liều chiếu tia gamma (nguồn Co60)đến tỷ lệ sống của chồi in vitro của 3 giống khoai môn sọ nghiên cứu
Giống khoai
Công thức Liều chiếu
(Gy)
Số chồi/lần nhắc lại
Tỉ lệ sống của các chồi sau xử lý chiếu xạ (%)
1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần
Cụ Cang (Sơn La) Đ/C 0 50 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 1 10 50 95,50 ± 0,71 86,50 ± 0,71 75,00 ± 1,41 68,50 ± 0,71 2 20 50 93,00 ± 0,00 81,00 ± 1,41 61,50 ± 2,12 55,00 ± 0,00 3 30 50 89,00 ± 1,41 75,00 ± 1,41 54,00 ± 1,41 48,00 ± 1,41 4 50 50 78,50 ± 0,71 66,00 ± 1,41 45,50 ± 0,71 28,50 ± 2,12 5 70 50 59,50 ± 0,71 33,50 ± 0,71 23,00 ± 1,41 15,00 ± 5,66 6 90 50 46,00 ± 1,41 30,50 ± 0,71 21,50 ± 2,12 8,00 ± 1,41 Môn thơm (Lạng Sơn) Đ/C 0 50 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 1 10 50 92,50 ± 0,71 82,50 ± 0,71 63,50 ± 0,71 57,00 ± 1,41 2 20 50 90,50 ± 0,71 74,00 ± 1,41 59,00 ± 1,41 51,50 ± 0,71 3 30 50 8850 ± 0,71 65,00 ± 1,41 52,00 ± 1,41 50,50 ± 0,71 4 50 50 69,50 ± 2,12 61,00 ± 1,41 48,00 ± 0,00 35,00 ± 1,41 5 70 50 54,50 ± 4,95 36,50 ± 2,12 24,50 ± 0,71 11,50 ± 0,71 6 90 50 44,50 ± 2,12 28,50 ± 2,12 18,50 ± 0,71 5,00 ± 0,71 Sáp Vàng (Thanh Hóa) Đ/C 0 50 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00 1 10 50 97,00 ± 0,00 86,00 ± 1,41 67,00 ± 1,41 58,50 ± 0,71 2 20 50 91,00 ± 1,41 73,50 ± 0,71 58,50 ± 0,71 55,50 ± 0,71 3 30 50 88,50 ± 0,71 67,00 ± 1,41 46,50 ± 0,71 42,50 ± 0,71 4 50 50 74,50 ± 0,71 45,50 ± 0,71 28,50 ± 0,71 32,00 ± 1,41 5 70 50 61,00 ± 1,41 49,50 ± 0,71 24,00 ± 5,66 28,50 ± 0,71 6 90 50 46,50 ± 2,12 29,00 ± 1,41 18,50 ± 0,71 9,50 ± 0,71
Kết quả ở bảng 3.24 cho thấy:
Tia gamma đã ảnh hưởng tới sự sống sót của các chồi khoai môn sọ in vitro. Khi liều chiếu tăng từ 10 Gy đến 90 Gy, tỷ lệ sống sót giảm từ 68,50 ± 0,71% (ở giống khoai Cụ Cang) đến 5,00 ± 0,71% (ở giống khoai Môn thơm) sau 4 tuần theo dõi.
Với các liều chiếu từ 10 – 50 Gy, tỷ lệ sống sót giảm ít trong tuần đầu, giảm mạnh nhất trong tuần 2 và 3, sau đó giảm ít dần trong tuần 4. Với liều chiếu 70 – 90 Gy, tỷ lệ sống giảm mạnh ngay từ tuần đầu. Sau tuần thứ 4, một số chồi sống sót nhưng chất lượng rất kém, có hiện tượng thâm đen gốc, sinh trưởng kém và số lượng mẫu giống thu được rất ít vì vậy chúng bị loại bỏ và không theo dõi trong các nghiên cứu tiếp theo.
Liều chiếu xạ gây chết 50% (LD50) của chồi in vitro ở các giống khoai môn sọ được tính toán dựa trên tỉ lệ sống sót các chồi in vitro sau chiếu xạ 4 tuần (theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.5.1) là 11,2 Gy.
Từ kết quả đánh giá khả năng sống sót của chồi in vitro sau xử lí tia gamma, (chúng tôi nhận thấy, giới hạn trên trong xử lí tia gamma với chồi in vitro
các giống khoai môn sọ là 50 Gy Nếu vượt qua liều xạ này, đa số các chồi in vitro
chết hoặc chồi sinh trưởng rất kém. Kết quả thu được, cho thấy khoảng liều chiếu thích hợp cho chồi in vitro khoai môn sọ là từ 10 – 50 Gy.
Các chồi in vitro sống sót được đưa sang môi trường nhân nhanh, sau đó sang môi trường ra rễ để tạo cây in vitro hoàn chỉnh trước khi đưa ra trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng.
3.2.3.2. Ảnh hưởng của tia gamma (nguồn Co60) tới chồi và cây khoai môn sọ
in vitro
Ảnh hưởng của tia gmama tới sinh trưởng của chồi và cây khoai môn sọ in vitro được trình bày ở bảng 3.25.
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của tia gamma (nguồn Co60) tới hệ số nhân chồi in vitro và sinh trưởng của cây in vitro Giống Công thức Liều chiếu (Gy) Số chồi theo dõi
Hệ số nhân chồi in vitro qua các lần cấy chuyển
Sinh trưởng của chồi in
vitro ở lần nhân thứ 3 Khả năng ra rễ của chồi in vitro Lần 1 Lần 2 Lần 3 Chiều cao TB/chồi (cm) Số lá TB/chồi Tỷ lệ chồi ra rễ
(%) Số rễ TB/ cây Chiều dài trung bình (cm) Sau 2
tuần Sau 4 tuần Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 2 tuần Sau 4 tuần Cụ Cang (Sơn La) Đ/C 0.0 30 2,92 2,89 2,85 6,71 3,95 100 100 7,7 12,6 2,47 3,48 1 10 30 2,00 2,12 2,05 6,22 4,11 100 100 7,3 12,5 2,38 3,36 2 20 30 1,73 1,98 1,25 5,69 4,24 91,5 96,2 6,8 11,8 2,34 3,17 3 30 30 1,43 1,42 1,02 5,19 4,62 89,5 93,6 5,4 10,5 2,22 2,85 4 50 25 1,17 1,15 0,98 4,71 3,18 79,5 87,7 4,2 7,8 1,97 2,46 Môn thơm (Lạng Sơn) Đ/C 0.0 30 3,72 3,69 3,75 6,88 6,12 100 100 6,8 12,5 2,00 4,12 1 10 30 2,89 2,77 2,88 6,75 6,38 98,7 100 6,5 11,9 1,95 3,89 2 20 30 2,66 2,39 2,48 6,85 6,55 90,8 98,4 6,2 10,8 1,75 2,77 3 30 30 2,17 2,02 2,06 5,95 6,95 87,3 92,6 5,7 9,9 1,52 2,38 4 50 30 1,43 1,45 1,65 4,99 5,92 75,5 86,6 4,7 9,5 1,46 2,92 Sáp Vàng (Thanh Hóa) Đ/C 0.0 30 3,62 3,86 3,53 6,72 5,22 100 100 5,2 10,3 3,15 4,15 1 10 30 2,08 3,35 3,40 6,54 6,58 97,9 100 5,0 10,2 2,82 3,52 2 20 30 1,76 2,12 2,09 5,83 6,89 93,4 96,8 4,5 9,1 2,63 3,66 3 30 30 1,29 1,51 1,62 4,95 7,00 88,8 94,5 4,0 8,7 2,35 3,33 4 50 30 0,85 0,77 0,75 3,96 4,97 80,5 86,7 3,2 7,5 1,72 2,89 (Ghi chú: Đ/C: Đối chứng)
* Ảnh hưởng của tia gamma (nguồn Co60) ở các liều chiếu khác nhau đến hệ số nhân chồi in vitro của các giống khoai môn sọ nghiên cứu
Kết quả ở bảng 3.25 cho thấy:
Tia gamma có ảnh hưởng lớn tới hệ số nhân chồi in vitro của các giống khoai môn sọ nghiên cứu, các công thức chiếu xạ đều có hệ số nhân giảm so với đối chứng. Liều chiếu xạ càng tăng thì hệ số nhân chồi giảm càng mạnh.
Hệ số nhân ở các công thức xử lí chiếu xạ đã giảm thấp ngay trong lần cấy chuyển đầu tiên, sau đó tăng trở lại từ lần cấy chuyển thứ 2 và tương đối ổn định ở lần cấy chuyển thứ 3.
* Ảnh hưởng của liều chiếu tia gamma (nguồn Co60) đến sự sinh trưởng của các chồi khoai môn sọ in vitro ở lần nhân thứ 3
Tia phóng xạ gamma có ảnh hưởng rõ rệt tới sự sinh trưởng của chồi khoai môn sọ lần nhân thứ 3 (Bảng 3.25).
Khi liều chiếu xạ tăng từ 10 - 50 Gy, chiều cao trung bình của chồi giảm (từ 6,95 cm - 3,96 cm tùy giống).
Số lá trung bình của chồi ở các giống khoai môn sọ nghiên cứu đều tăng so với đối chứng ở liều chiếu xạ 10 – 30 Gy.Số lá trung bình trên một chồi giảm dần ở liều chiếu 50 Gy.
Qua theo dõi chúng tôi nhận thấy, ở các công thức chiếu xạ tuy số lá trung bình trên một chồi có tăng, song chất lượng chồi ở tất cả các công thức chiếu xạ đều kém hơn so với đối chứng: ở công thức chiếu xạ 10 – 30 Gy chồi chỉ đạt mức trung bình, ở công thức chiếu xạ 50 Gy chồi có chất lượng kém.
* Ảnh hưởng của liều chiếu tia gamma (nguồn Co60) tới khả năng ra rễ của chồi khoai môn sọ in vitro
Cùng với hệ số nhân, tỷ lệ ra rễ của chồi in vitro và chất lượng bộ rễ của cây in vitro là những chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của tia gamma đến sự sinh trưởng của cây.
Các chồi đạt tiêu chuẩn (cao 4 - 6 cm, có từ 3 - 7 lá/ chồi) được cấy chuyển vào môi trường ra rễ MS + 0,3 NAA. Đánh giá khả năng ra rễ ở thời điểm 2 tuần và 4 tuần sau khi cấy trên môi trường ra rễ (Bảng 3.25). Kết quả nghiên cứu cho thấy:
Trên 90% chồi được chiếu xạ ở liều 10 – 30 Gy sau 4 tuần nuôi cấy đều có rễ. Tuy nhiên, số lượng rễ trung bình và chiều dài trung bình của rễ giảm hơn so với đối chứng nhưng mức giảm này không nhiều và vẫn cho kết quả tốt khi cây phát triển trong vườn ươm.
* Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ khác nhau tới sự phát sinh các biến dị hình thái