5. Phương pháp nghiên cứu
2.1.2. Chế tạo hạt nano vàng (Au) và nano bạc (Ag)
a) Chế tạo hạt nano nano vàng (Au)
Trong luận văn này, chúng tôi chế tạo hạt nano vàng bằng phương pháp khử hóa học với quy trình cụ thể như sau:
- Bước 1: Pha dung dịch chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1% (dung dịch A) như sau :
Cho 0,25g Na3C6H5O7.2H2O vào 25ml nước cất hai lần, rung siêu âm đến khi tan hết. Ta được dung dịch chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1%.
- Bước 2: Pha dung dịch muối vàng HAuCl4.3H2O nồng độ 10mM (dung dịch B).
HAuCl4.3H2O có khối lượng nguyên tử là 393,97. Để có dung dịch muối vàng HAuCl4.3H2O nồng độ 10mM, ta cần pha 0,4g HAuCl4.3H2O với 10ml nước cất hai lần. Vì dung dịch HAuCl4.3H2O nhạy sáng, nên sau khi pha cần bọc kín bằng giấy bạc, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng.
Bước 3: Tiến hành thí nghiệm tạo hạt nano vàng.
Lấy 0,5 ml dung dịch B ở bước 2 pha với 10ml nước cất 2 lần vào cốc thủy tinh, lấy giấy bạc bịt kín miệng cốc. Cho cốc lên máy khuấy từ và khuấy đều trong 5 phút, sau đó gia nhiệt cho đến khi dung dịch đạt nhiệt độ 900C (dung dịch C).
Khi dung dịch trên đạt nhiệt độ 900C, lấy 0,2ml dung dịch A ở bước 1 nhỏ từng giọt vào dung dịch C. Phản ứng khử từ Au3+ thành Au xảy ra ngay khi cho dung dịch A vào. Quan sát màu sắc dung dịch B khi cho dung dịch A vào: màu sắc của muối vàng thay đổi từ màu vàng đặc trưng sang trong suốt, khi cho chất khử vào lập tức chuyển thành màu tím đem, sau đó chuyển dần sang màu đỏ sậm.
Hình 2.1. Quy trình chế tạo hạt nano Au
b) Chế tạo hạt nano nano bạc (Ag)
Trong đề tài này, chúng tôi chế tạo nano bạc bằng phương pháp khử hóa học, cụ thể như sau:
- Bước 1: Đầu tiên pha dung dịch chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1% Như sau:
Lấy 25ml nước cất cho vào 0,25g Na3C6H5O7.2H2O sau đó rung siêu âm cho đến khi dung dịch hòa tan không còn cặn
- Bước 2: Lấy 20ml dung dịch AgNO3 nồng độ 1mM, bọc kín bằng giấy bạc khuấy từ gia nhiệt đến 80oC.
- Bước 3: Khi dung dịch AgNO3 đạt nhiệt độ 80oC, cho 2 ml chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1% nhỏ từng giọt vào dung dịch. Tiếp tục khuấy từ, gia nhiệt ở 80oC trong vòng 3-5 phút. Ta thấy dung dịch có sự thay đổi màu sắc từ trắng trong suốt sang đen rồi ngả dần về màu vàng nhạt.
2.1.3. Tiến hành nghiên cứu phổ hấp thụ của nano Au và nano Ag
Để tiến hành đo phổ hấp thụ của các mẫu nano Au và nano Ag, chúng tôi sử dụng máy đo phổ hấp thụ UV – Vis Jenway 6800 đặt tại phòng thí nghiệm của Trường đại học Quy Nhơn.
Sử dụng phổ hấp thụ để phân tích một số tính chất của mẫu, có độ nhạy cao, mẫu không bị phá hủy.
Hình 2.2. Máy đo phổ hấp thụ UV – Vis Jenway 6800
* Sử dụng máy máy đo phổ hấp thụ UV – Vis Jenway 6800 theo các bước:
Bước 1: Khởi động máy:
- Khởi động máy tính và máy đo.
- Khởi động phần mềm Flight Deck 1.0 chọn Connect.
(Trong thời gian này không mở buồng đo của máy UV – Vis cho tới khi màn hình hiển thị Ready ở góc phải)
Bước 2: Quét đường nền của phổ hấp thụ: - Đặt 2 cuvet vào buồng đo
(Dùng giấy mịn làm sạch cuvet trước khi đưa vào buồng đo)
- Chọn Tab Spectrum Scan, đợi cho màn hình xuất hiện chữ Ready. - Chọn Tab Baseline để quét đường nền. Khi máy quét xong: chọn Tab Auto Zero để hiệu chỉnh kết quả đo.
Bước 3: Khảo sát phổ hấp thụ của một số chất lỏng: - Đổ dung dịch nước cần đo vào trong cuvet 1 .
- Sau khi máy đo xong lấy dung dịch trong cuvet 1 đổ ra ngoài, tắt máy UV- Vis và máy tính.
Bước 4: Xử lý số liệu
- Copy số liệu vào phần mềm Origin, vẽ phổ hấp thụ A f( ) .
- Xác định đỉnh cực đại của phổ hấp thụ và độ hấp thụ A tại đỉnh cực đại này.
* Xử lý số liệu:
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng phần mềm Origin 8.0 để xử lý số liệu. Các số liệu đo phổ hấp thụ được thu thập dưới dạng excel, sau đó tôi tiến hành copy số liệu đưa vào phần mềm Origin 8.0 để vẽ đồ thị. Đối với các hạt nano Ag, các đỉnh hấp thụ có được là do hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt. Dựa vào sự phụ thuộc vị trí đỉnh hấp thụ vào hình dạng, kích thước của hạt nano, chúng tôi khảo sát hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt của hạt nano Ag, phụ thuộc vào hình dạng, kích thước hạt.
Trong quá trình làm thực nghiệm, chúng tôi đã tìm hiểu và chế tạo được Ag kích thước nano, dạng hạt, tìm hiểu về cấu tạo, nguyên lý hoạt động, phương pháp đo phổ hấp thụ. Kết quả của quá trình thực nghiệm sẽ được trình bày cụ thể trong chương sau.
2.2. PHƯƠNG PHÁP KẾT HỢP PHỔ SERS VÀ TLC ĐỂ PHÁT HIỆN DƯỢC LIỆU NHANH PIPERINE VÀ CURCUMIN
a) Phát hiện nhanh và khảo sát dược liệu Piperine bằng phương pháp kết hợp phổ SERS và TLC
Bước 1: Các bước thực hiện sắc ký bản mỏng
- Cho dung môi Toluene: ethyl acetate pha với tỉ lệ 7:3 vào bình triển khai sắc ký, đặt vào đó một mẫu giấy lọc rồi đậy kín bình, để yên ít phút đến khi dung môi trong bình ổn định.
mao quản loại caphina có đường kính d 2m, nhỏ 1 giọt chất lên bản mỏng sao cho vết chấm nhỏ và tròn ở tuyến xuất phát.
- Dùng máy sấy sấy nhẹ để đuổi hết dung môi khỏi vệt chấm rồi đặt bản mỏng thẳng đứng hoặc lệch 75o so với phương nằm ngang vào bình triển khai sắc ký, chú ý sao cho dung môi trong bình triển khai nằm dưới vạch xuất phát và đi lên đều. Tiến hành triển khai sắc ký đến khi dung môi chạm đến vạch mép trên thì lấy bản mỏng ra
- Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm (hoặc có cách khác là dùng thuốc hiện là dung dịch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu)
Bước 2: Gắn các hạt nano Ag lên các phân tử dược liệu
Nhỏ 1 giọt dung dịch nano Ag đã chế tạo được lên vị trí đã xác định được vệt chất ở trên.
Bước 3: So sánh Rf của piperine chiết suất từ tiêu đen Bình định so với piperine chuẩn
Bước 4: Đo phổ Raman của vệt chất Piperine, sử dụng laser 785 nm và thời gian lấy phổ là 10s.
b) Phát hiện nhanh và khảo sát dược liệu Curcumin bằng phương pháp kết hợp phổ SERS và TLC
Bước 1: Các bước thực hiện sắc ký bản mỏng
- Cho dung môi Dichlormethane: ethyl acetate pha với tỉ lệ 1:0; 1:1; 3:1; 4:1; 5:1;và 6:1 vào bình triển khai sắc ký, đặt vào đó một mẫu giấy lọc rồi đậy kín bình, để yên ít phút đến khi dung môi trong bình ổn định.
- Mẫu chất được pha loãng trong dung môi methanol CH3OH, dùng mao quản loại caphina có đường kính d 2m, nhỏ 1 giọt chất lên bản mỏng sao cho vết chấm nhỏ và tròn ở tuyến xuất phát.
mỏng thẳng đứng hoặc lệch 75o so với phương nằm ngang vào bình triển khai sắc ký, chú ý sao cho dung môi trong bình triển khai nằm dưới vạch xuất phát và đi lên đều. Tiến hành triển khai sắc ký đến khi dung môi chạm đến vạch mép trên thì lấy bản mỏng ra
- Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm (hoặc có cách khác là dùng thuốc hiện là dung dịch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu)
Bước 2:
- Gắn các hạt nano Ag lên các phân tử dược liệu
Nhỏ 1 giọt dung dịch nano Ag đã chế tạo được lên vị trí đã xác định được vệt chất ở trên.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG VÀ NANO BẠC 3.1.1. Dung dịch nano bạc 3.1.1. Dung dịch nano bạc
Hình 3.1 cho thấy dung dịch nano Ag được chế tạo bằng phương pháp khử hóa học. Quan sát màu sắc, chúng tôi thấy các hạt Ag được chế tạo có màu vàng đặc trưng của hạt nano Ag, dung dịch đều màu và đồng nhất. Qua quá trình chế tạo chúng tôi nhận thấy dung dịch các hạt nano bạc có thể giữ màu tốt trong vòng một tuần. Sau đó màu sắc và độ đồng nhất của dung dịch bị thay đổi. Điều này có thể được giải thích do các hạt nano Ag bị oxy hóa, do vậy các hạt nano Ag nên được sử dụng ngay sau chế tạo để tránh bị oxy hóa làm thay đổi tính chất của hạt nano này.
Hình 3.1. Dung dịch hạt nano Ag được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học
Sự hình thành các hạt nano Ag được giải thích dựa theo phương trình phản ứng hình thành các hạt nano Ag như phương trình (3.1):
Dung dịch hạt nano Ag có màu vàng đều và rất đồng nhất, điều đó cho thấy các hạt nano Ag hình thành tốt và phản ứng tạo hạt nano Ag xảy ra hoàn toàn trong các điều kiện khảo sát, điều này được thể hiện ở hình 3.1
3.1.2. Dung dịch nano vàng
Quan sát hình 3.2, dung dịch nano Au có màu rượu nho, rất đồng đều. Qua quá trình khảo sát thí nghiệm, trong thời gian 4 tuần các hạt nano Au trong dung dịch không bị vón cục, kết tụ. Điều này chứng tỏ dung dịch nano Au chúng tôi đã chế tạo có tính ổn định cao. So với các hạt nano Ag thì màu sắc và độ đồng nhất dung dịch các hạt nano Au được giữ lâu hơn. Điều này được giải thích do Au có độ bền hóa học cao hơn Ag rất nhiều.
Hình 3.2. Dung dịch nano Au được chế tạo bằng Phương pháp khử hóa học từ tiền chất HAuCl4
Phương trình phản ứng hình thành các hạt nano Au được biểu diễn như phương trình (3.2):
3HAuCl4(aq) + 3 C6H5O73–(aq) + 3 H2O(l) → 4 Au(s) + 6 CO2(g) + 3 C4H6O4(aq) + 7H+ (aq) + 16 Cl– (aq) (3.2)
Trong đó C4H6O4(aq) là succinic acid
3.1.3. Ảnh TEM của hạt nano Au và hạt nano Ag a)Ảnh TEM của hạt nano Au a)Ảnh TEM của hạt nano Au
Hình 3.3. Ảnh TEM của các hạt nano Au
Kết quả ảnh TEM của các hạt nano Au tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học cho thấy các hạt có dạng gần giống hình cầu, tương đối đồng đều và có đường kính trung bình nằm trong khoản 18-22 nm.
b) Ảnh TEM của hạt nano Ag
Sau khi chế tạo được dung dịch nano Ag bằng phương pháp khử hóa học với chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1%. Kết quả ảnh TEM như hình 3.4
Mẫu được gởi đi chụp ảnh TEM được chế tạo dùng 20 ml AgNO3 1mM và 2 ml chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1%. Quan sát kết quả, chúng tôi thấy, các hạt nano Ag trong dung dịch có cả dạng hình cầu (chiếm đa số) và dạng thanh, đường kính trung bình từ 15 nm đến 30 nm. Kết quả ảnh TEM cũng cho thấy hình dạng và kích thước của các hạt nano Ag ít đồng đều hơn so với các hạt nano Au tổng hợp bằng quy trình tương tự.
3.2. ẢNH SEM CỦA BẢN MỎNG TLC VÀ BẢN MỎNG CÓ GẮN CÁC HẠT NANO BẠC HẠT NANO BẠC
Ảnh SEM của bản mỏng TLC và hạt nano Ag
Hình 3.5. Ảnh SEM bản mỏng sau khi chạy sắc ký với curcumin
Sau khi chạy chất phân tích piperine và curcumin trên sắc ký bản mỏng, kết quả cho thấy
Đối với piperine thì L0= 8,43 cm, L= 4,3 cm nên giá trị R=0,51 Đối với curcumin: L0=4,2 cm; L=3 cm và R=3/4,2 =0,71
Hình 3.5 cho thấy hình dạng của sắc ký bản mỏng và vết của chất curcumin sau khi chạy chất này trên bản mỏng (hình bên trái) với dung môi
đã được xác định trong bình triển khai sắc ký. Hình bên phải là ảnh SEM của bản mỏng TLC gồm các hạt silica SiO2 kích thước trung bình từ vài chục đến vài trăm micrometer. Vạch số 1 là vạch xuất phát, là nơi chất cần phân tích được chấm lên trên TLC, vạch số 2 là vạch đích nơi mà dung môi chạm đến trong khi chạy sắc ký, vạch số 1’ là vị trí mà chất cần phân tích chạm tới nhờ dung môi mang đi trong mao dẫn (trong khi các hạt silica tương tác với curcumin và muốn giữ các phân tử này lại vị trí lại). Kết quả là R= 0,71 và 0,51 được thiết lập, và phù hợp kết quả chạy sắc ký bản mỏng của chất curcumin và piperine chuẩn (thương mại).
Việc xác định vết các hạt nano Ag (cỡ 20 nm) và chất phân tích (phân tử kết đám cỡ vài nanometer) trên trên bản mỏng TLC là rất khó khăn để quan sát bằng ảnh SEM do kích thước của các hạt nano rất bé. Ngoài ra, các phân tử hữu cơ hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên để xác định vết các chất trong kỹ thuật sắc ký người ta hay dùng đèn UV, việc xác định vết của piperine là một ví dụ. Trường hợp đặc biệt curcumin là chất hấp thụ ánh sáng ngay trong vùng khả kiến nên thấy vệt màu vàng trên TLC.
Kết quả đo phổ hấp thụ UV-vis như hình 3.6 cho thấy các hạt nao vàng có đỉnh hấp thụ tại 523 nm còn các hạt nano Ag thì lại có đỉnh hấp thụ tại 429 nm. Sự mở rộng của đỉnh hấp thụ cho thấy các hạt nano Au và Ag tổng hợp được có kích thước không đều. Sự xuất hiện đỉnh phổ tại 429 nm và 523 nm được cho là do hiện tượng cổng hưởng plasmon bề mặt gây ra đối với các kim loại Au và Ag. Kết quả về phổ hấp thụ UV-vis phù hợp với các công bố về hạt nano Ag và Au. [37], [38], [39]
Hình 3.6. Phổ hâp thụ UV-vis của các hạt nano Ag (màu xanh, phía dưới) và nano Au (màu đỏ, phía trên)
3.4. KẾT QUẢ ĐO HỒNG NGOẠI CỦA PIPERINE VÀ CURCUMIN 3.4.1. Kết quả đo phổ IR của piperine 3.4.1. Kết quả đo phổ IR của piperine
Kết quả đo phổ IR của các phân tử piperine như hình 3.7, cấu trúc phân tử piperine như hình 3.8. Bảng 3.1 là cho biết thông tin về tần số (số sóng) mà các phân tử piperine đã hấp thụ tương ứng với các nhóm chức có mặt trong phân tử piperine như biểu diễn ở hình 3.8.
Hình 3.8 Cấu trúc phân tử pinerine
Bảng 3.1. Số sóng hấp thụ theo tính toán và quan sát thực nghiệm và các nhóm chức tương ứng trong phân tử piperine [40], [41]
Tần số (số sóng)theo lý thuyết (cm-1)
Số sóng theo thực
nghiệm (cm-1) Tên nhóm chức/liên kết
997 Dao động uốn CH nhóm -
CH=CH-
1050-1150 1069 Dao động uốn -C-H
1200-1250 1254
Dao động giãn bất đối xứng =C-O-C , –CH2 twisting và – CH2 rocking
1300-1580 1254; 1584 Dao động giãn đối xứng C=C (Benzene ring)
~1450 1449 Dao động uốn C-H2
~1634 1634 C=O Ketone
1700 1748 Dao động giãn -CO-N
2859-2941 2842 Dao động giãn đối xứng và bất đối xứng C-H2 3006 3009 Dao động giãn C-H vòng thơm 3200-3500 Dao động N-H 3300-3600 3420 Dao động nhóm O-H Alcohol với đỉnh phổ mạnh và mở rộng
3.4.2. Kết quả phổ IR của curcumin
Hình 3.9. Phổ IR của phân tử curcumin
Bảng 3.2. Các kiểu dao động của phân tử curcumin trong nghệ [42] Tần số ν
(cm-1) Kiểu dao động
3508 Dao động giãn OH nhóm phenol và liên kết -H- trong phân tử 1627 Dao động giãn C-O và Cring-C=C
1602 Dao động giãn C=C của vòng thơm
1508 Dao động giãn C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O