5. Phương pháp nghiên cứu
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU
1.3.1. Dược liệu piperine và Curcumin
a) Dược liệu piperine
Hạt tiêu đen thường được dùng để làm gia vị trong lĩnh vực ẩm thực bởi có vị cay, nồng. Bên cạnh là gia vị, hồ tiêu còn được sử dụng rộng rãi trong y học như: thuốc kích thích tiêu hóa, giúp tăng cường hệ miễn dịch và ngăn ngừa sự hủy hoại các tế bào gây ra bệnh ung thư và tim mạch, chữa bệnh động kinh, bệnh tiêu chảy, bệnh quai bị,…
Piperrine là một alkaloid có vị rất cay, là thành phần chính tạo nên vị cay của hồ tiêu. Piperine là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, gây ức chế được các en-zyme tham gia vào chuyển hóa sinh học của nhiều loại thuốc, có khả năng tương tác với các loại thuốc chống lao Isoniazi, làm giảm đào thải curcumin... trong một số nghiên cứu y học gần đây đã có kết luận rằng piperrine là một loại dược phẩm có chức năng hỗ trợ điều trị các căn bệnh nan y mà không để lại di căn cho người bệnh như: ung thư gan, ung thư vú, tim mạch, viêm loét dạ dày, viêm gan, lão hóa…
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của piperine
- Tính chất vật lý của Piperine: Có trong hạt tiêu từ 5-9% tinh thể không màu, không mùi, không tan trong nước sôi, rất tan trong rượu nóng, đồng phân với morphin…
Như vậy, piperine là một hợp chất có hoạt tính sinh học với phổ hoạt tính rộng. Tuy nhiên, các ứng dụng trong y sinh của nó vẫn còn hạn chế do tính sinh khả dụng kém và độ hòa tan trong nước thấp. Vấn đề này có thể được cải thiện bằng cách kết hợp phân tử piperine với một số hợp chất thân nước như tá dược cyclodextrin (CD) (Hình 1.5).
Hình 1.6. Phổ FT-Raman của piperine nguyên chất (A), quả ớt xanh nguyên vẹn (B), hạt tiêu đen (C) và hạt tiêu đen oleoresin (D)
Như được minh họa trong Hình 1.6 phổ Raman thu được từ quả ớt xanh còn nguyên vẹn, hạt tiêu đen và oleoresin tiêu đen cho thấy chủ yếu là các dải quan trọng của piperine. Dao động xảy ra trong phạm vi phổ trong khoảng từ 1000 đến 1630 cm-1; Dao động hóa trị của C = C nhân benzen cũng như dao động hóa trị của O = C - N được phát hiện trong khoảng 1580 đến 1635 cm-1; Dao động biến dạng của -CH2- được quan sát ở khoảng 1448 cm-1; Tín hiệu của dao động bất đối xứng và đối xứng -CH2- được quan sát ở khoảng 2859 - 1941 cm-1; Dao động hóa trị bất đối xứng của = C – O – C ở khoảng 1193- 1253 cm-1, và dao động hóa trị đối xứng của = C–O – C ở khoảng 1031 cm-1. Các thuộc tính hóa học và tác dụng dược lý của piperine đã cho thấy tiềm năng của hợp chất này trong ngành hóa dược và y sinh. Ngoài ra, sự kết hợp của các kỹ thuật lý thuyết và thực nghiệm có thể mở đường cho các ứng dụng y sinh và dược lý có hiệu quả hơn nữa của hợp chất piperine cũng như các dẫn chất mới tương tự piperine trong lĩnh vực y sinh học hiện đại.
b) Dược liệu Curcumin
(A) Cur (B) DMC (C) BDMC
Hình 1.7. Ba thành phần chủ yếu trong curcuminoid
Cấu trúc của curcuminoid(C21H20O6) được xác định lần đầu tiên vào năm 1910 (Kazimierz Kostanecki, J. Miłobędzka and Wiktor Lampe). Curcuminoid là những dẫn xuất diarylheptan gồm Cur, DCM, BDCM. Chúng là những hợp chất phenolic, hầu hết các dẫn xuất đều khác nhau nhóm thế trên gốc phenyl. Hợp chất chiếm chủ yếu và được nghiên cứu nhiều nhất là cur (khoảng 77%), tiếp theo là DMC (17%) và BDMC (3%) [28], [29]. Cur tinh khiết rất hiếm và đắt trong khi DCM và BDCM vẫn chưa có trên thị trường. Ngoài ra còn có các loại tinh dầu quan trọng khác như turmerone, atlantone, và zingiberene. Các thành phần này có cấu trúc hóa học khác nhau nên cũng có màu sắc và tính chất hóa học khác nhau.
Hình 1.8. Công thức hóa học chung của curcuminoid
Danh pháp quốc tế của các curcuminoid:
- Cur: 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5- dione[28]
1,6-diene-3,5-dione [29].
Hình 1.9. Công thức hóa học của Demetoxycurcumin
- BDCM: 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione [29].
Hình 1.10. Công thức hóa học của Bisdemetoxycurcumin
- Tính chất vật lý
Curcumin từ nghệ có dạng bột màu vàng cam huỳnh quang, không mùi, bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng. Nhiệt độ nóng chảy 1800 C ÷ 1850C. Khi ở dạng dung dịch cur dễ bị phân hủy bởi ánh sáng và nhiệt độ, tan trong chất béo, etanol, metanol, diclometan, aceton, acid acetic và hầu như không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan <10mg ở 250C). Tan trong môi trường kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu rồi ngã tím, tan trong môi trường acid có màu đỏ tươi [30].
- Ứng dụng của curcumin + Hoạt tính chống oxy hóa
Gốc tự do là các chất phản ứng mạnh, được tạo ra khi cơ thể chúng ta thu nhận khí oxy hoặc chuyển hóa thức ăn để tạo ra năng lượng. Bản thân các gốc tự do góp phần vào quá trình lão hóa tự nhiên của cơ thể. Tuy nhiên, nếu số lượng gốc tự nhiên quá nhiều có thể gây tổn thương các tế bào lành và
thậm chí có thể là nguyên nhân chính dẫn đến một số bệnh như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên [31], [32].
Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được. Để hạn chế hoạt động của gốc tự do người ta dùng chất chống oxy hóa [32].
Curcuminoid là hợp chất tự nhiên có khả năng chống oxy hóa. Nó có khả năng ngăn cản sự tạo thành gốc tự do như superoxide, hydroxyl. Ngăn cản sự peroxide hóa các lipid trong cơ thể nhờ vào nhóm OH trên vòng bezen [33].
Một số ứng dụng khác về khả năng chống oxy hóa của curcuminoid như: dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm, giúp thực phẩm không bị ôi thiu do sự oxy hóa dầu mỡ trong quá trình bảo quản và lưu trữ.
+ Hoạt tính kháng viêm, kháng virus, vi khuẩn và kí sinh trùng
Viêm nhiễm là một chuỗi phản ứng của cơ thể nhằm chống lại tổn thương mô. Phản ứng này cần thiếc cho quá trình lành viết thương, nhưng đồng thời cũng tạo ra sự đau đớn kết hợp với nổi mẫn đỏ và phồng viết thương.
Trong quá trình viêm nhiễm, cơ thể sinh ra một chất giống hormon là arachidonic acid. Arachidonic acid dưới tác dụng của enzym cylooxygenase sẽ bị chuyển hóa thành các hợp chất: prostaglandin (PG), thromboxan (TX), hydroxyeicosatetraenoid acid (HETE), leukotrien (LT). Một số PG làm giản mạch máu, trong khi LT làm tăng khả năng thấm qua mạch làm trương phồng mô dẫn đến quá trình viêm. Lượng PG tăng lên gây mẫn đỏ, trương phồng,
đau nhức vết thương; còn TX có thể ngăn quá trình cung cấp máu và năng lượng cho tế bào [34].
Nghiên cứu về cấu trúc hóa học của cur kết hợp với hoạt tính sinh học cho thấy rằng sự hiện diện của liên kết đôi ở C3,4 và C3’,4’ và nhóm OH ở C8,8‟ trên vòng bezen tạo ra hoạt tính kháng viêm cho cur [35].
Chất kháng viêm có khả năng ngăn cản enzym cyclooxygenase và lipoxygenase – nhóm động của enzym sẽ làm giảm sản phẩm gây viêm từ sự chuyển hóa của arachidonic acid.
Curcumin được dùng trong điều trị HIV nhờ khả năng chống lại virus [32]. Dịch trích cồn của nghệ còn có tác dụng kháng khuẩn.
Dịch trích cloroform và eter của nghệ có khả năng kháng nấm gây viêm da. Hỗn hợp các cur, DCM và BDCM còn có thể kháng giun [29].
Hoạt tính chống đông máu
Sự kết tụ của các tiểu huyết cầu trong máu sẽ gây ra hiện tượng đông máu. Cur có khả năng ngăn cản hoạt động của enzym cyclooxyenase tạo thêm tiểu huyết cầu, nên cur có tác dụng chống đông máu [36].
+ Ngăn cản và điều trị ung thư
Curcumin có khả năng ức chế sự tạo khối u, tác động đến hầu hết các giai đoạn của quá trình hình thành và phát triển khối u [32] đột biến phát triển di chuyển
Hình 1.11. Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin
Khối u di căn Curcumin Khối u tăng trưởng Tế bào ung thư Tế bào bình thường
Trong giai đoạn đầu của bệnh, các tế bào bình thường bị tác động bởi các gốc tự do và bị biến đổi thành các tế bào ung thư. Cur có thể ngăn chặn quá trình này bằng cách bắt giữ các gốc oxy hóa khác nhau như: gốc hydroxyl OH+, gốc peroxyl ROO+, singlet oxygen, nitric oxide NO và peroxynitrite ONO-[18]. Cur có khả năng bảo vệ lipid, hemoglobin và AND khỏi quá trình oxy hóa. Cur tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn DMC và BDMC. Cur được chứng minh có khả năng chống di căn đối với một vài loại tế bào ung thư đồng thời ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Khả năng làm giảm quá trình di căn này còn phụ thuộc vào nguồn gốc và loại khối u ác tính [32].
+ Trong công nghiệp thực phẩm
Curcumin đã được các tổ chức FDA ở Mỹ, Canada và EU cho phép sử dụng làm chất màu (mã số E100) để tạo màu vàng hay vàng cam cho nước giải khát, pho mát, cà ri, mù tạt… Liều lượng sử dụng cho phép là 0 ÷ 0.5mg/kg thể trọng.
+ Trong công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm
Hiện nay, Curcumin ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là thực phẩm chức năng giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị ung thư, viêm loét dạ dày tá tràng, giải độc gan, tăng sức đề kháng của cơ thể. Nó được dùng dưới nhiều dạng: bột, viên ép, viên con nhộng, dạng trà, dạng thuốc tinh chất để tăng thêm việc tiêu hoá và chức năng gan, để giảm đau khớp và điều hoà kinh. Vì nghệ có nhiều ứng dụng trong y học nên nó đã được nhiều nhà sản xuất quan tâm và cho ra nhiều sản phẩm trên thị trường như Biocurmin của công ty TNHH Dược phẩm Châu Á (Biocurmin là sự kết hợp giữa nghệ và tiêu giúp choviệc hấp thụ nghệ trong dạ dày nhanh hơn); sản phẩm Bách phụ khang của Công ty TNHHTM Mediproducts (đây là sự kết hợp giữa cur và trinh nữ hoàng cung giúp điều trị bệnh u xơ tử cung)….
1.3.2. Phổ tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) và ứng dụng trong phân tích thuốc, dược liệu chiết suất từ thực vật
1.3.2.1. Khái niệm plasmon bề mặt
Plasmon bề mặt là những sóng điện từ được truyền dọc theo giao diện kim loại - điện môi. Đơn giản hơn, ta có thể định nghĩa: plasmon bề mặt là sự dao động của điện tử tự do ở bề mặt của hạt nano với sự kích thích của ánh sáng tới. Cường độ điện trường của plasmon bề mặt giảm theo hàm mũ khi xa dần giao diện kim loại - điện môi.
1.3.2.2. Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt
Hình 1.12. Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt [22]
Hiện tượng “cộng hưởng plasmon bề mặt” (SPR) được giải thích là: điện trường của sóng điện từ tác động lên các electron tự do trên bề mặt hạt nano, làm electron bị dồn về một phía, gây ra sự phân cực. Sau đó, dưới tác dụng của lực phục hồi Coulombic, các electron sẽ trở lại vị trí ban đầu. Vì có bản chất sóng, nên điện trường dao động làm cho sự phân cực này dao động theo. Sự dao động này được gọi là “plasmon” [1]. Khi tần số dao động của đám mây electron trùng với tần số của một bức xạ điện từ nào đó, sẽ gây ra sự dao động đồng loạt của các electron tự do. Hiện tượng này gọi là “cộng hưởng plasmon bề mặt” (SPR). Như vậy, hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt là sự kích thích các electron tự do bên trong vùng dẫn, dẫn tới sự hình thành các dao động đồng pha. Khi kích thước của một tinh thể kim loại nhỏ
hơn bước sóng của bức xạ tới, khi tần số photon tới cộng hưởng với tần số dao động của electron tự do ở bề mặt sẽ xuất hiện hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt.
Hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt là hiệu ứng đặc trưng của các hạt nano kim loại. Vì trong kim loại có rất nhiều điện tử tự do nên khi hấp thụ ánh sáng chiếu vào các điện tử tự do này sẽ dao động tập thể, tạo nên các dao động đồng pha.
Đối với hạt bạc nano, dao động cộng hưởng plasmon dẫn tới sự hấp thụ mạnh ánh sáng vùng khả kiến. Số lượng và vị trí cộng hưởng plasmon phụ thuộc chủ yếu vào kích thước và hình thái của hạt bạc nano. Vì vậy, đỉnh cộng hưởng có thể xuất hiện trong vùng khả kiến đến vùng hồng ngoại gần. Ngoài ra, hằng số điện môi của vật liệu cấu trúc nano, chỉ số khúc xạ của môi trường xung quanh, trạng thái của bề mặt (dung môi, chất ổn định) hay khoảng cách giữa các hạt cũng ảnh hưởng đến vị trí và hình dạng của đỉnh phổ khi có cộng hưởng plasmon bề mặt.
1.3.2.3. Tán xạ Raman
Tán xạ Raman là hiện tượng bức xạ điện từ tương tác với các phân tử vật chất. Hiện tượng tán xạ ánh sáng có thể xảy ra trong sự tương tác của ánh sáng với từng phần tử riêng biết. Từ đầu thế kỉ 20, nhiều nhà vật lí đã tiên đoán rằng bức xạ bị tán xạ bới phân tử không chỉ chưa photon với tần số ánh sáng tới mà còn gồm photon với tần số bị thay đổi. Vào năm 1928, khẳng định này đã được làm rõ với nhiều thí nghiệm tán xạ ánh sáng trên chất lỏng Benzen do Chandresekhara Venkata Raman thực hiện. Raman đã được giải Nobel và từ đó hiện tượng tán xạ này gọi là tán xạ Raman. Những vạch có tấn số nhỏ hơn tần số ánh sáng tới (vi<vo) gọi là tán xạ Stokes, những vạch có tấn số lớn hơn tần số ánh sáng tới (vi>vo) gọi là tán xạ anti-Stokes. Dịch chuyển tần số của các vạch này so với vạch Rayleigh ∆v = |vo - vi| là đặc trưng cho
mỗi vật chất và không phụ thuộc vào tần số của ánh sáng tới [2].
Tán xạ Raman là một công cụ rất hữu ích để xác định cấu trúc phân tử. Điều này xuất phát từ nguồn gốc xuất hiện của loại tán xạ này. Trong hiện tượng tán xạ Raman, ánh sáng tới được tán xạ không đàn hồi bởi vật liệu và tần số của nó bị dịch đi một khoảng bằng năng lượng dao động của phân tử của vật liệu đó. Vì vậy, phổ tán xạ Raman cung cấp thông tin về các dao động phân tử và do mỗi loại phân tử đều có một số loại dao động đặc trưng nên nó cho biết thành phần phân tử của chất được phân tích [23].
1.3.2.4. Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Surface Enhanced Raman Spectroscopy – SERS)
Việc nghiên cứu tán xạ Raman lại bị hạn chế rất nhiều do xác suất xảy ra rất thấp của nó. Người ta đã tính ra rằng, trung bình chỉ có một photon tán xạ Raman trong số 106 – 108 photon rơi vào vật liệu [23]. Chính vì vậy mà cường độ Raman đo được thường rất yếu. Vào năm 1974, bước ngoặt lớn đã xảy ra khi nhóm nghiên cứu của Fleischmann đã phát hiện ra sự có mặt của một điện cực bạc nhám sẽ làm tăng cường độ tín hiệu Raman của pyridine hấp thụ trên bề mặt điện cực đó tăng nhiều lần [24]. Người ta gọi hiệu ứng này là tán xạ Raman tăng cường bề mặt– SERS. Từ đây, bắt đầu kỷ nguyên của “Tán xạ Raman tăng cường bề mặt” – kỹ thuật phân tích xác định lượng vết của phân tử hữu cơ và sinh học
Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn chưa rõ các lý do cụ thể gây ra SERS. Tuy nhiên, các nghiên cứu công bố đều đồng ý rằng nguyên nhân chủ