5. Phương pháp nghiên cứu
3.4. KẾT QUẢ ĐO HỒNG NGOẠI CỦA PIPERINE VÀ CURCUMIN
3.4.1. Kết quả đo phổ IR của piperine
Kết quả đo phổ IR của các phân tử piperine như hình 3.7, cấu trúc phân tử piperine như hình 3.8. Bảng 3.1 là cho biết thông tin về tần số (số sóng) mà các phân tử piperine đã hấp thụ tương ứng với các nhóm chức có mặt trong phân tử piperine như biểu diễn ở hình 3.8.
Hình 3.8 Cấu trúc phân tử pinerine
Bảng 3.1. Số sóng hấp thụ theo tính toán và quan sát thực nghiệm và các nhóm chức tương ứng trong phân tử piperine [40], [41]
Tần số (số sóng)theo lý thuyết (cm-1)
Số sóng theo thực
nghiệm (cm-1) Tên nhóm chức/liên kết
997 Dao động uốn CH nhóm -
CH=CH-
1050-1150 1069 Dao động uốn -C-H
1200-1250 1254
Dao động giãn bất đối xứng =C-O-C , –CH2 twisting và – CH2 rocking
1300-1580 1254; 1584 Dao động giãn đối xứng C=C (Benzene ring)
~1450 1449 Dao động uốn C-H2
~1634 1634 C=O Ketone
1700 1748 Dao động giãn -CO-N
2859-2941 2842 Dao động giãn đối xứng và bất đối xứng C-H2 3006 3009 Dao động giãn C-H vòng thơm 3200-3500 Dao động N-H 3300-3600 3420 Dao động nhóm O-H Alcohol với đỉnh phổ mạnh và mở rộng
3.4.2. Kết quả phổ IR của curcumin
Hình 3.9. Phổ IR của phân tử curcumin
Bảng 3.2. Các kiểu dao động của phân tử curcumin trong nghệ [42] Tần số ν
(cm-1) Kiểu dao động
3508 Dao động giãn OH nhóm phenol và liên kết -H- trong phân tử 1627 Dao động giãn C-O và Cring-C=C
1602 Dao động giãn C=C của vòng thơm
1508 Dao động giãn C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O 1429 Dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm (CCC, CCH),
enolic (COH) và nhóm CH của CH2
Tần số ν
(cm-1) Kiểu dao động
1282 Dao động uốn đồng phẳng CH của C=CH, dao động kéo C-O vòng thơm
1153 Dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH, skeletal CCH 1028 Dao động giãn C-O-C, dao động uốn ngoài mặt phẳng CH3,
dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH
962 Dao động giãn C=O stretching, dao động uốn đồng phẳng CCH
856 Dao động uốn ngoài mặt phẳng nhóm CH của vòng thơm CCH và skeletal CCH
744 Dao động uốn đồng phẳng vòng thơm CCH và skeletal CCH, dao động giãn C=C
Nguồn: internet
Kết quả đo phổ hồng ngoại của phân tử curcumin trong nghệ như hình 3.9. Các tần số hấp thụ tiêu biểu và các dao động tương ứng như chỉ ra trong bảng 3.2. Trong đó các dao động quan trọng cho phổ hấp thụ tại 3508 cm-1 do liên kết OH; 1028 cm-1 do dao động liên kết COC là các nhóm chức quan trọng trong việc chống lại tác nhân oxy hóa. Ngoài ra phổ IR còn cho thấy sự hấp thụ rất mạnh tại các tần số 1508; 1282; 962 cm-1 là do các dao động kéo C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O; dao động uốn đồng phẳng CH của C=CH, dao động kéo C-O vòng thơm; dao động kéo C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O. [42], [43]
3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT PIPERINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP TLC KẾT HỢP VỚI SERS KẾT HỢP VỚI SERS
Kết quả khảo sát piperine bằng sắc kí bản mỏng:
Ứng với dung môi trong bình triển khai sắc ký Toluene: ethyl acetate theo tỉ lệ 7:3
Hình 3.11. Mẫu sắc ký bản mỏng
Đối Với Lo = 8,43 cm, L = 4,3 cm thì hệ số Rf đối piperine được xác định như sau:
Rf =
L
L0 = 0,51
Sau khi khảo sát Piperine bằng phương pháp TLC, chúng tôi tiến hành đo phổ tán xạ Raman với bước sóng laser kích thích là 785 nm, thời gian 10s, kết quả đo Raman trên vết piperine trên bản mỏng TLC sau khi nhỏ dung dịch các hạt nano Ag đã được tổng hợp như trên được thể hiện như trong hình 3.12. Ở đây chúng tôi lựa chọn sử dụng laser 785 nm vì với bước sóng này thì năng lượng không quá lớn (như laser xanh lá 532 nm hoặc laser đỏ 633 nm) nhằm không phá hỏng mẫu trong quá trình ghi tín hiệu Raman.
Hình 3.12. Phổ Raman của phân tử piperine nguyên chất
Dao động thường xảy ra trong phạm vi phổ khoảng từ 1000 đến 1630 cm-1; dao động -C=C- nhân benzene (aromatic) cũng như dao động kéo của O=C-N nằm trong khoảng 1580 đến 1635 cm-1; dao động uốn của -CH2- được quan sát ở bước sóng 1445 cm-1. Trong dải bước sóng từ 1100 and 1400 cm-1:
dao động tại tần số 1152 cm-1 là do dao động kéo –C-C-, dao động –CH2
twisting và –CH2 rocking quan sát tại 1291 and 1256 cm-1. Dao động tại 1020 cm-1 là dao động kéo C-O-C, dao động uốn ngoài mặt phẳng CH3, dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH. Đây là một số đỉnh tiêu biểu hoạt động Raman rất mạnh của phân tử piperine trong tiêu đen. [44]
Bảng 3.3 cho thấy vị trí các đỉnh Raman, diện tích, chiều cao đỉnh phổ và bề rộng đỉnh phổ tương ứng với 13 đỉnh dao động của piperine được model sử dụng hàm Gaussian. Kết quả cho thấy một số đỉnh cường độ mạnh, diện tích đỉnh phổ và chiều cao phổ tương đối lớn tại bước sóng 1626; 1581; 1445; 1291; 1152; 1133 cm-1. Tất cả các đỉnh phổ này rất hẹp dao động từ 6-16cm-1.
Bảng 3.3. Các đỉnh dao động Raman thu được từ hình 3.11
STT Loại đỉnh Vị trí
đỉnh Diện tích Chiều cao
Bề rộng đỉnh (FWHM) 1 Gaussian 1020 1033 152 6 2 Gaussian 1104 29310 1154 24 3 Gaussian 1133 16833 1765 9 4 Gaussian 1152 21817 1880 11 5 Gaussian 1201 7315 624 11 6 Gaussian 1256 16115 944 16 7 Gaussian 1291 15299 1305 11 8 Gaussian 1348 2889 206 13 9 Gaussian 1366 8323 717 11 10 Gaussian 1445 30164 2132 13 11 Gaussian 1581 32121 2440 12 12 Gaussian 1598 23886 1757 13 13 Gaussian 1626 52676 3027 16
Quan sát hình 3.13, phổ Raman của piperine trên bản mỏng TLC khi chưa đính hạt nano Ag thì không xuất hiện các đỉnh phổ dao động tương ứng với các liên kết trong phân tử piperine (Hình 3.13b). Tuy nhiên khi được đính các hạt nano Ag thì xuất hiện các đỉnh phổ Raman của piperine như quan sát ở hình 3.13a. Điều này có thể giải thích là do piperine được pha loãng ở nồng độ thấp thì không thấy xuất hiện đỉnh phổ Raman như trên đồ thị hình 3.13b. Nhờ có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt của các hạt nano Ag, khi gắn các hạt nano Ag vào piperine tín hiệu Raman của Piperine được tăng cường
Đáng chú ý là lượng mẫu piperine được sử dụng trên bản mỏng TLC cỡ khoảng 1/100-1/1000 lượng piperine nguyên chất (rắn) được sử dụng để trong phép đo Raman như thể hiện hình 3.12.
Hình 3.13. Phổ SERS của Piperine trên bản sắc kí trước và sau khi đính các hạt nano Ag
Hình 3.14. Phổ Raman của piperine trên bản sắc kí được đính các hạt nano Ag
Từ hình 3.14 ta thấy các đỉnh dao động phổ SERS của piperine (model bằng hàm Gausian) cho thấy các đỉnh phổ tại 1073 cm-1do dao động uốn -C- H; dao động tại tần số 1169 cm-1 là do dao động giãn –C-C-; tại 1262 cm-1do dao động giãn bất đối xứng =C-O-C , –CH2 twisting và –CH2 rocking; dao động tại 1380 cm-1 được cho là do dao động giãn đối xứng C=C, skeletal CCC và dao động uốn đồng phẳng nhóm CH, dao động tại 1585 cm-1 là do dao động giãn C=C của vòng thơm và dao động giãn của O=C-N[45].
Hình 3.15 cho thấy 05 phổ Raman tại vết piperine trên bản mỏng TLC sau khi đính các hạt nano Ag. Kết quả cho thấy cả 05 vị trí này đều cho tín hiệu Raman của piperine, tuy nhiên cường độ và độ phân giải của các đỉnh phổ lân là khác nhau. Có 03 vị trí cho cường độ Raman rất mạnh và ổn định nhất là tại các tần số 1073; 1380 và 1585 cm-1. Các đỉnh này là do dao động uốn C-H; dao động giãn đối xứng C=C, skeletal CCC; dao động giãn C=C của vòng thơm[40], [45]. Kết quả phổ SERS cho thấy các hạt nano Ag đã đính
trên các phân tử piperine đang nằm phẳng trên bản mỏng TLC như Hình 3.16, nghĩa là các liên kết này luôn nằm gần bề mặt các hạt nano Ag nhất và do đó tín hiệu dao động từ các liên kết này được khuếch đại và luôn được quan sát trên trên phổ SERS với cường độ lớn và ổn định. Còn các đỉnh phổ khác lúc thì được khuếch đại, lúc thì không được quan sát thấy trên phổ, điều này được giải thích do các dao động hoặc liên kết này có thể nằm gần hoặc xa bề mặt Ag tùy theo vị trí trên bản mỏng TLC do sự sắp xếp ngẫu nhiên của các hạt nano Ag.
Hình 3.15. Phổ SERS của piperine tại 5 vị trí khác nhau tại vệt piperine trên bản mỏng TLC
Hình 3.17 so sánh phổ hồng ngoại (hình 3.17a), phổ Raman thuần (hình 3.17b) của bột rắn piperine nguyên chất và phổ SERS (hình 3.17c) của piperine trên bản mỏng TLC. Kết quả cho thấy:
- Về mật độ số lượng mẫu cần thiết khi phân tích : khi đo phổ IR và phổ Raman thì cần một lượng lớn các phân tử piperine (thường dùng piperine rắn và nguyên chất, không pha loãng), còn đo phổ SERS thì piperine được pha loãng và ở nồng độ thấp hơn từ 1/100-1/1000 lần so với đo IR hoặc Raman.
- Về số đỉnh phổ: số đỉnh phổ khi đo phổ SERS ít hơn và đỉnh phổ mở rộng hơn so với phổ Raman của piperine nguyên chất hay phổ IR. Điều này được giải thích là do khi đo IR hay Raman thì cần thiết phải dùng một lượng mẫu lớn, do đó rất nhiều các phân tử sắp xếp một cách ngẫu nhiên, do vậy hầu như xuất hiện tất cả các dao động có thể có. Còn đối với phổ SERS thì lý thuyết và thực nghiệm đã chứng minh chỉ các phân tử (hay các liên kết phân tử) nằm gần bề mặt các hạt nano Ag thì tín hiệu mới được tăng cường dựa trên hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt. Do vậy số dao động có tín hiệu Raman được khuếch đại ít đi và đỉnh phổ mở rộng hơn.
So sánh hình 3.17a và 3.17b ta thấy nhiều đỉnh phổ Raman và hồng ngoại trùng nhau, tuy nhiên cũng có một số đỉnh phổ có cường độ lớn ở phổ IR nhưng lại bé ở phổ Raman và ngược lại. Tương tư như vậy, hình 3.17 cũng cho thấy có một số đỉnh xuất hiện ở phổ IR nhưng lại không xuất hiện ở phổ Raman và ngược lại. Điều này được giải thích dựa trên quy luật chọn lọc (selection rule). So sánh 3 hình 3.17a, b và c cho thấy các đỉnh phổ SERS của piperine (trong vùng màu xanh thì có thể quan sát trên cả phổ Raman và SERS), tuy nhiên các đỉnh (trong vùng màu đỏ) thì chỉ quan sát ở phổ SERS mà không được nhìn thấy trên phổ Raman nhưng lại xuất hiện trên phổ IR, điều này có thể giải thích do tín hiệu IR thường mạnh hơn tín hiệu Raman, và các dao động này có thể nằm gần bề mặt hạt nano Ag hoặc khe hẹp (nanogap) giữa các hạt Ag nên tin hiệu được tăng cường.
3.6. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CURCUMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TLC KẾT HỢP VỚI SERS KẾT HỢP VỚI SERS
Hình 3.18 cho thấy hình ảnh curcumin trên bản TLC theo các tỷ lệ dung môi Dichlormethane: ethyl acetate tương ứng là 1:0; 1:1; 3:1; 4:1; 5:1; 6:1. Kết quả cho thấy nếu chọn tỷ lệ dung môi khác nhau thì R f sẽ khác nhau.
Tỷ lệ dung môi Dichlormethane : ethyl acetate
1:0 1:1 3:1
4:1 5:1 6:1
Đối với dung môi dichlormethane : ethyl acetate tỷ lệ 6:1 thì ta có
Với Lo = 4,2 cm, L = 3cm thì hệ số Rf đối curcumin được xác định như sau:
Rf =
L
L0 = 0,71
Hình 3.19. Phổ IR curcumin (hình trên) và phổ Raman (hình dưới)
Hình 3.19 cho thấy phổ IR và phổ Raman của phân tử curcumin. Tương tự như phổ IR và Raman phân tử piperine, có rất nhiều vị trí đỉnh phổ trùng nhau, tuy nhiên có những dao động mạnh ở phổ Raman nhưng yếu ở phổ IR (ví dụ dao động tần số 1601 cm-1), và ngược lại dao động rất mạnh ở phổ IR lại yếu hoặc không tìm thấy ở phổ Raman (ví dụ như dao động tại tần số 1510; 1151 cm-1). Qua đó ta thấy rõ IR và Raman là hai kỹ thuật bổ trợ nhau
(complemetary techniques). Curcumin có các dao động Raman rất mạnh tại tần số 963; 1182; 1252 và 1602 cm-1, các dao động này là do dao động giãn C=O stretching; dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH, skeletal CCH dao động uốn đồng phẳng CCH; dao động uốn đồng phẳng CH của C=CH, dao động kéo C-O vòng thơm; và, dao động giãn C=C của vòng thơm. Các dao động Raman của phân tử curcumin chủ yếu nằm trong vùng tần số từ 900-1650 cm-1[46].
Hình 3.20. Phổ Raman phân tử curcumin trên TLC (hình trên) và
Ag/curcumin/TLC
Hình 3.21. Phổ Raman (hình trên) của Ag gắn TiO2/Curcumin/TLC và ảnh SEM
tương ứng (hình dưới)
Kết quả đo Raman của curcumin sau khi nhỏ dung dịch các hạt nano Ag tại vết curcumin trên bản mỏng TLC được thể hiện như hình 3.20 (hình dưới), và phổ Raman của vết curcumin trên TLC (hình trên). Cả hai phổ đều cho thấy
đường nền cao và mở rộng và không có tín hiệu Raman của phân tử curcumin . Điều này được giải thích do curcumin (màu vàng) hấp thụ trong vùng nhìn thấy nên cũng phát huỳnh quang trong vùng nhìn thấy, do đó rất khó xuất hiện đỉnh phổ Raman trong cả hai trường hợp do số lượng phân tử curcumin thấp (vài nghìn phân tử) và hạt nano Ag không thể làm tăng cường tín hiệu Raman và dập tắt huỳnh quang. Tuy nhiên thay vì nhỏ dung dịch hạt nano Ag, chúng tôi nhỏ dung dịch Ag gắn TiO2 lên vết curcumin trên TLC (hình 3.21, phía dưới), chúng tôi thấy xuất hiện một số đỉnh của curcumin. Tuy nhiên các phổ này (tại 4 điểm khác nhau) không tương đồng tại các vị trí khác nhau trên vết curcumin (hình 3.21, phía trên). Điều này là do lượng vật liệu Ag gắn TiO2 và cả curcumin phân bố không đồng đều tại các vị trí khác nhau trên vệt curcumin trên TLC. Phổ SERS của 4 điểm này có đặc điểm chung là đỉnh phổ mở rộng từ 1100 cm-1 tới 1600 cm-1, điều này do vùng tần số này tập trung rất nhiều các dao động phân tử curcumin như quan sát ở phổ IR và Raman phía trên.
Hình 3.22. Phổ SERS (màu đen, phía dưới) và phổ Raman của curcumin (màu đỏ, phía trên)
Hình 3.22 cho thấy so sánh giữa phổ SERS và phổ Raman của curcumin, kết quả cho thấy có một số đỉnh trên phổ SERS trùng với phổ Raman tại dao động có tần số 931; 1168; 1302 và 1534 cm-1. Các dao động này là do dao động giãn C=O stretching, dao động uốn đồng phẳng CCH; dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH, skeletal CCH; dao động uốn đồng phẳng của CH, enolic COH, skeletal CCC; Dao động giãn C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Đã thành công trong việc chế tạo các hạt nano Au và Ag, kết quả ảnh TEM cho thấy các hạt nano Au có dạng hình cầu đường kính trung bình cỡ 18-20 nm, còn các hạt nano Ag có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau. Kết quả phổ hấp thụ UV-vis cho thấy xuất hiện đỉnh cộng hưởng plasmon bề mặt tại 429 nm đối với nano Ag và 523 nm đối với hạt nano Au.
Chúng tôi đã tìm hiểu hai kỹ thuật phân tích các chất là kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC) và kỹ thuật Raman hoặc kỹ thuật SERS, và vận dụng thành công trong việc kết hợp hai kỹ thuật này để phân tích nhanh các chất, ví dụ piperine và curcumin
Đã khảo sát và tìm ra dung môi thích hợp tạo pha động trong kỹ thuật TLC cho thấy rõ vệt của phân tử piperine và curcumin. Kết quả Rf của mẫu được chiết tách từ thực vật (hồ tiêu và nghệ ở Bình Định) phù hợp kết quả