5. Phương pháp nghiên cứu
3.1. KẾT QUẢ CHẾ TẠO HẠT NANO VÀNG VÀ NANO BẠC
3.1.1. Dung dịch nano bạc
Hình 3.1 cho thấy dung dịch nano Ag được chế tạo bằng phương pháp khử hóa học. Quan sát màu sắc, chúng tôi thấy các hạt Ag được chế tạo có màu vàng đặc trưng của hạt nano Ag, dung dịch đều màu và đồng nhất. Qua quá trình chế tạo chúng tôi nhận thấy dung dịch các hạt nano bạc có thể giữ màu tốt trong vòng một tuần. Sau đó màu sắc và độ đồng nhất của dung dịch bị thay đổi. Điều này có thể được giải thích do các hạt nano Ag bị oxy hóa, do vậy các hạt nano Ag nên được sử dụng ngay sau chế tạo để tránh bị oxy hóa làm thay đổi tính chất của hạt nano này.
Hình 3.1. Dung dịch hạt nano Ag được tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học
Sự hình thành các hạt nano Ag được giải thích dựa theo phương trình phản ứng hình thành các hạt nano Ag như phương trình (3.1):
Dung dịch hạt nano Ag có màu vàng đều và rất đồng nhất, điều đó cho thấy các hạt nano Ag hình thành tốt và phản ứng tạo hạt nano Ag xảy ra hoàn toàn trong các điều kiện khảo sát, điều này được thể hiện ở hình 3.1
3.1.2. Dung dịch nano vàng
Quan sát hình 3.2, dung dịch nano Au có màu rượu nho, rất đồng đều. Qua quá trình khảo sát thí nghiệm, trong thời gian 4 tuần các hạt nano Au trong dung dịch không bị vón cục, kết tụ. Điều này chứng tỏ dung dịch nano Au chúng tôi đã chế tạo có tính ổn định cao. So với các hạt nano Ag thì màu sắc và độ đồng nhất dung dịch các hạt nano Au được giữ lâu hơn. Điều này được giải thích do Au có độ bền hóa học cao hơn Ag rất nhiều.
Hình 3.2. Dung dịch nano Au được chế tạo bằng Phương pháp khử hóa học từ tiền chất HAuCl4
Phương trình phản ứng hình thành các hạt nano Au được biểu diễn như phương trình (3.2):
3HAuCl4(aq) + 3 C6H5O73–(aq) + 3 H2O(l) → 4 Au(s) + 6 CO2(g) + 3 C4H6O4(aq) + 7H+ (aq) + 16 Cl– (aq) (3.2)
Trong đó C4H6O4(aq) là succinic acid
3.1.3. Ảnh TEM của hạt nano Au và hạt nano Ag a)Ảnh TEM của hạt nano Au a)Ảnh TEM của hạt nano Au
Hình 3.3. Ảnh TEM của các hạt nano Au
Kết quả ảnh TEM của các hạt nano Au tổng hợp bằng phương pháp khử hóa học cho thấy các hạt có dạng gần giống hình cầu, tương đối đồng đều và có đường kính trung bình nằm trong khoản 18-22 nm.
b) Ảnh TEM của hạt nano Ag
Sau khi chế tạo được dung dịch nano Ag bằng phương pháp khử hóa học với chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1%. Kết quả ảnh TEM như hình 3.4
Mẫu được gởi đi chụp ảnh TEM được chế tạo dùng 20 ml AgNO3 1mM và 2 ml chất khử Na3C6H5O7.2H2O nồng độ 1%. Quan sát kết quả, chúng tôi thấy, các hạt nano Ag trong dung dịch có cả dạng hình cầu (chiếm đa số) và dạng thanh, đường kính trung bình từ 15 nm đến 30 nm. Kết quả ảnh TEM cũng cho thấy hình dạng và kích thước của các hạt nano Ag ít đồng đều hơn so với các hạt nano Au tổng hợp bằng quy trình tương tự.
3.2. ẢNH SEM CỦA BẢN MỎNG TLC VÀ BẢN MỎNG CÓ GẮN CÁC HẠT NANO BẠC HẠT NANO BẠC
Ảnh SEM của bản mỏng TLC và hạt nano Ag
Hình 3.5. Ảnh SEM bản mỏng sau khi chạy sắc ký với curcumin
Sau khi chạy chất phân tích piperine và curcumin trên sắc ký bản mỏng, kết quả cho thấy
Đối với piperine thì L0= 8,43 cm, L= 4,3 cm nên giá trị R=0,51 Đối với curcumin: L0=4,2 cm; L=3 cm và R=3/4,2 =0,71
Hình 3.5 cho thấy hình dạng của sắc ký bản mỏng và vết của chất curcumin sau khi chạy chất này trên bản mỏng (hình bên trái) với dung môi
đã được xác định trong bình triển khai sắc ký. Hình bên phải là ảnh SEM của bản mỏng TLC gồm các hạt silica SiO2 kích thước trung bình từ vài chục đến vài trăm micrometer. Vạch số 1 là vạch xuất phát, là nơi chất cần phân tích được chấm lên trên TLC, vạch số 2 là vạch đích nơi mà dung môi chạm đến trong khi chạy sắc ký, vạch số 1’ là vị trí mà chất cần phân tích chạm tới nhờ dung môi mang đi trong mao dẫn (trong khi các hạt silica tương tác với curcumin và muốn giữ các phân tử này lại vị trí lại). Kết quả là R= 0,71 và 0,51 được thiết lập, và phù hợp kết quả chạy sắc ký bản mỏng của chất curcumin và piperine chuẩn (thương mại).
Việc xác định vết các hạt nano Ag (cỡ 20 nm) và chất phân tích (phân tử kết đám cỡ vài nanometer) trên trên bản mỏng TLC là rất khó khăn để quan sát bằng ảnh SEM do kích thước của các hạt nano rất bé. Ngoài ra, các phân tử hữu cơ hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên để xác định vết các chất trong kỹ thuật sắc ký người ta hay dùng đèn UV, việc xác định vết của piperine là một ví dụ. Trường hợp đặc biệt curcumin là chất hấp thụ ánh sáng ngay trong vùng khả kiến nên thấy vệt màu vàng trên TLC.
Kết quả đo phổ hấp thụ UV-vis như hình 3.6 cho thấy các hạt nao vàng có đỉnh hấp thụ tại 523 nm còn các hạt nano Ag thì lại có đỉnh hấp thụ tại 429 nm. Sự mở rộng của đỉnh hấp thụ cho thấy các hạt nano Au và Ag tổng hợp được có kích thước không đều. Sự xuất hiện đỉnh phổ tại 429 nm và 523 nm được cho là do hiện tượng cổng hưởng plasmon bề mặt gây ra đối với các kim loại Au và Ag. Kết quả về phổ hấp thụ UV-vis phù hợp với các công bố về hạt nano Ag và Au. [37], [38], [39]
Hình 3.6. Phổ hâp thụ UV-vis của các hạt nano Ag (màu xanh, phía dưới) và nano Au (màu đỏ, phía trên)
3.4. KẾT QUẢ ĐO HỒNG NGOẠI CỦA PIPERINE VÀ CURCUMIN 3.4.1. Kết quả đo phổ IR của piperine 3.4.1. Kết quả đo phổ IR của piperine
Kết quả đo phổ IR của các phân tử piperine như hình 3.7, cấu trúc phân tử piperine như hình 3.8. Bảng 3.1 là cho biết thông tin về tần số (số sóng) mà các phân tử piperine đã hấp thụ tương ứng với các nhóm chức có mặt trong phân tử piperine như biểu diễn ở hình 3.8.
Hình 3.8 Cấu trúc phân tử pinerine
Bảng 3.1. Số sóng hấp thụ theo tính toán và quan sát thực nghiệm và các nhóm chức tương ứng trong phân tử piperine [40], [41]
Tần số (số sóng)theo lý thuyết (cm-1)
Số sóng theo thực
nghiệm (cm-1) Tên nhóm chức/liên kết
997 Dao động uốn CH nhóm -
CH=CH-
1050-1150 1069 Dao động uốn -C-H
1200-1250 1254
Dao động giãn bất đối xứng =C-O-C , –CH2 twisting và – CH2 rocking
1300-1580 1254; 1584 Dao động giãn đối xứng C=C (Benzene ring)
~1450 1449 Dao động uốn C-H2
~1634 1634 C=O Ketone
1700 1748 Dao động giãn -CO-N
2859-2941 2842 Dao động giãn đối xứng và bất đối xứng C-H2 3006 3009 Dao động giãn C-H vòng thơm 3200-3500 Dao động N-H 3300-3600 3420 Dao động nhóm O-H Alcohol với đỉnh phổ mạnh và mở rộng
3.4.2. Kết quả phổ IR của curcumin
Hình 3.9. Phổ IR của phân tử curcumin
Bảng 3.2. Các kiểu dao động của phân tử curcumin trong nghệ [42] Tần số ν
(cm-1) Kiểu dao động
3508 Dao động giãn OH nhóm phenol và liên kết -H- trong phân tử 1627 Dao động giãn C-O và Cring-C=C
1602 Dao động giãn C=C của vòng thơm
1508 Dao động giãn C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O 1429 Dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm (CCC, CCH),
enolic (COH) và nhóm CH của CH2
Tần số ν
(cm-1) Kiểu dao động
1282 Dao động uốn đồng phẳng CH của C=CH, dao động kéo C-O vòng thơm
1153 Dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH, skeletal CCH 1028 Dao động giãn C-O-C, dao động uốn ngoài mặt phẳng CH3,
dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH
962 Dao động giãn C=O stretching, dao động uốn đồng phẳng CCH
856 Dao động uốn ngoài mặt phẳng nhóm CH của vòng thơm CCH và skeletal CCH
744 Dao động uốn đồng phẳng vòng thơm CCH và skeletal CCH, dao động giãn C=C
Nguồn: internet
Kết quả đo phổ hồng ngoại của phân tử curcumin trong nghệ như hình 3.9. Các tần số hấp thụ tiêu biểu và các dao động tương ứng như chỉ ra trong bảng 3.2. Trong đó các dao động quan trọng cho phổ hấp thụ tại 3508 cm-1 do liên kết OH; 1028 cm-1 do dao động liên kết COC là các nhóm chức quan trọng trong việc chống lại tác nhân oxy hóa. Ngoài ra phổ IR còn cho thấy sự hấp thụ rất mạnh tại các tần số 1508; 1282; 962 cm-1 là do các dao động kéo C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O; dao động uốn đồng phẳng CH của C=CH, dao động kéo C-O vòng thơm; dao động kéo C=O, dao động uốn đồng phẳng CCC, CC=O. [42], [43]
3.5. KẾT QUẢ KHẢO SÁT PIPERINE BẰNG PHƯƠNG PHÁP TLC KẾT HỢP VỚI SERS KẾT HỢP VỚI SERS
Kết quả khảo sát piperine bằng sắc kí bản mỏng:
Ứng với dung môi trong bình triển khai sắc ký Toluene: ethyl acetate theo tỉ lệ 7:3
Hình 3.11. Mẫu sắc ký bản mỏng
Đối Với Lo = 8,43 cm, L = 4,3 cm thì hệ số Rf đối piperine được xác định như sau:
Rf =
L
L0 = 0,51
Sau khi khảo sát Piperine bằng phương pháp TLC, chúng tôi tiến hành đo phổ tán xạ Raman với bước sóng laser kích thích là 785 nm, thời gian 10s, kết quả đo Raman trên vết piperine trên bản mỏng TLC sau khi nhỏ dung dịch các hạt nano Ag đã được tổng hợp như trên được thể hiện như trong hình 3.12. Ở đây chúng tôi lựa chọn sử dụng laser 785 nm vì với bước sóng này thì năng lượng không quá lớn (như laser xanh lá 532 nm hoặc laser đỏ 633 nm) nhằm không phá hỏng mẫu trong quá trình ghi tín hiệu Raman.
Hình 3.12. Phổ Raman của phân tử piperine nguyên chất
Dao động thường xảy ra trong phạm vi phổ khoảng từ 1000 đến 1630 cm-1; dao động -C=C- nhân benzene (aromatic) cũng như dao động kéo của O=C-N nằm trong khoảng 1580 đến 1635 cm-1; dao động uốn của -CH2- được quan sát ở bước sóng 1445 cm-1. Trong dải bước sóng từ 1100 and 1400 cm-1:
dao động tại tần số 1152 cm-1 là do dao động kéo –C-C-, dao động –CH2
twisting và –CH2 rocking quan sát tại 1291 and 1256 cm-1. Dao động tại 1020 cm-1 là dao động kéo C-O-C, dao động uốn ngoài mặt phẳng CH3, dao động uốn đồng phẳng của vòng thơm CCH. Đây là một số đỉnh tiêu biểu hoạt động Raman rất mạnh của phân tử piperine trong tiêu đen. [44]
Bảng 3.3 cho thấy vị trí các đỉnh Raman, diện tích, chiều cao đỉnh phổ và bề rộng đỉnh phổ tương ứng với 13 đỉnh dao động của piperine được model sử dụng hàm Gaussian. Kết quả cho thấy một số đỉnh cường độ mạnh, diện tích đỉnh phổ và chiều cao phổ tương đối lớn tại bước sóng 1626; 1581; 1445; 1291; 1152; 1133 cm-1. Tất cả các đỉnh phổ này rất hẹp dao động từ 6-16cm-1.
Bảng 3.3. Các đỉnh dao động Raman thu được từ hình 3.11
STT Loại đỉnh Vị trí
đỉnh Diện tích Chiều cao
Bề rộng đỉnh (FWHM) 1 Gaussian 1020 1033 152 6 2 Gaussian 1104 29310 1154 24 3 Gaussian 1133 16833 1765 9 4 Gaussian 1152 21817 1880 11 5 Gaussian 1201 7315 624 11 6 Gaussian 1256 16115 944 16 7 Gaussian 1291 15299 1305 11 8 Gaussian 1348 2889 206 13 9 Gaussian 1366 8323 717 11 10 Gaussian 1445 30164 2132 13 11 Gaussian 1581 32121 2440 12 12 Gaussian 1598 23886 1757 13 13 Gaussian 1626 52676 3027 16
Quan sát hình 3.13, phổ Raman của piperine trên bản mỏng TLC khi chưa đính hạt nano Ag thì không xuất hiện các đỉnh phổ dao động tương ứng với các liên kết trong phân tử piperine (Hình 3.13b). Tuy nhiên khi được đính các hạt nano Ag thì xuất hiện các đỉnh phổ Raman của piperine như quan sát ở hình 3.13a. Điều này có thể giải thích là do piperine được pha loãng ở nồng độ thấp thì không thấy xuất hiện đỉnh phổ Raman như trên đồ thị hình 3.13b. Nhờ có hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt của các hạt nano Ag, khi gắn các hạt nano Ag vào piperine tín hiệu Raman của Piperine được tăng cường
Đáng chú ý là lượng mẫu piperine được sử dụng trên bản mỏng TLC cỡ khoảng 1/100-1/1000 lượng piperine nguyên chất (rắn) được sử dụng để trong phép đo Raman như thể hiện hình 3.12.
Hình 3.13. Phổ SERS của Piperine trên bản sắc kí trước và sau khi đính các hạt nano Ag
Hình 3.14. Phổ Raman của piperine trên bản sắc kí được đính các hạt nano Ag
Từ hình 3.14 ta thấy các đỉnh dao động phổ SERS của piperine (model bằng hàm Gausian) cho thấy các đỉnh phổ tại 1073 cm-1do dao động uốn -C- H; dao động tại tần số 1169 cm-1 là do dao động giãn –C-C-; tại 1262 cm-1do dao động giãn bất đối xứng =C-O-C , –CH2 twisting và –CH2 rocking; dao động tại 1380 cm-1 được cho là do dao động giãn đối xứng C=C, skeletal CCC và dao động uốn đồng phẳng nhóm CH, dao động tại 1585 cm-1 là do dao động giãn C=C của vòng thơm và dao động giãn của O=C-N[45].
Hình 3.15 cho thấy 05 phổ Raman tại vết piperine trên bản mỏng TLC sau khi đính các hạt nano Ag. Kết quả cho thấy cả 05 vị trí này đều cho tín hiệu Raman của piperine, tuy nhiên cường độ và độ phân giải của các đỉnh phổ lân là khác nhau. Có 03 vị trí cho cường độ Raman rất mạnh và ổn định nhất là tại các tần số 1073; 1380 và 1585 cm-1. Các đỉnh này là do dao động uốn C-H; dao động giãn đối xứng C=C, skeletal CCC; dao động giãn C=C của vòng thơm[40], [45]. Kết quả phổ SERS cho thấy các hạt nano Ag đã đính
trên các phân tử piperine đang nằm phẳng trên bản mỏng TLC như Hình 3.16, nghĩa là các liên kết này luôn nằm gần bề mặt các hạt nano Ag nhất và do đó tín hiệu dao động từ các liên kết này được khuếch đại và luôn được quan sát trên trên phổ SERS với cường độ lớn và ổn định. Còn các đỉnh phổ khác lúc thì được khuếch đại, lúc thì không được quan sát thấy trên phổ, điều này được giải thích do các dao động hoặc liên kết này có thể nằm gần hoặc xa bề mặt Ag tùy theo vị trí trên bản mỏng TLC do sự sắp xếp ngẫu nhiên của các hạt nano Ag.
Hình 3.15. Phổ SERS của piperine tại 5 vị trí khác nhau tại vệt piperine trên bản mỏng TLC
Hình 3.17 so sánh phổ hồng ngoại (hình 3.17a), phổ Raman thuần (hình 3.17b) của bột rắn piperine nguyên chất và phổ SERS (hình 3.17c) của piperine trên bản mỏng TLC. Kết quả cho thấy:
- Về mật độ số lượng mẫu cần thiết khi phân tích : khi đo phổ IR và phổ Raman thì cần một lượng lớn các phân tử piperine (thường dùng piperine rắn và nguyên chất, không pha loãng), còn đo phổ SERS thì piperine được pha loãng và ở nồng độ thấp hơn từ 1/100-1/1000 lần so với đo IR hoặc Raman.
- Về số đỉnh phổ: số đỉnh phổ khi đo phổ SERS ít hơn và đỉnh phổ mở rộng hơn so với phổ Raman của piperine nguyên chất hay phổ IR. Điều này được giải thích là do khi đo IR hay Raman thì cần thiết phải dùng một lượng mẫu lớn, do đó rất nhiều các phân tử sắp xếp một cách ngẫu nhiên, do vậy hầu như xuất hiện tất cả các dao động có thể có. Còn đối với phổ SERS thì lý thuyết và thực nghiệm đã chứng minh chỉ các phân tử (hay các liên kết phân tử) nằm gần bề mặt các hạt nano Ag thì tín hiệu mới được tăng cường dựa trên hiệu ứng cộng hưởng plasmon bề mặt. Do vậy số dao động có tín hiệu