1.3.3.1.Vai trò của một số chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme
Ascorbic (vitamin C) có trong tế bào thực vật là một trong những chất
cần thiết cho quá trình trao đổi chất của tế bào. Ascorbic còn loại các gốc tự do, là một trong những thành phần chính của chu trình ascorbate-glutathion trong tế bào để thực hiện chức năng này. Không có sự tham gia của các enzyme, ascorbic vẫn có thể trực tiếp tác động (giống như SOD) lên superoxide.
Ngoài ra, ascorbic còn có vai trò giúp điều chỉnh stress oxy hóa ở thực vật qua cơ chế tự kiểm soát ROS thông qua hợp tác với glutathione. Ngoài ra, bằng cách gián tiếp, ascorbic phục hồi các gốc tự do trên màng như gốc tocopherol tự do. Gốc này được hình thành sau khi khử các gốc tự do khác trên màng tế bào [11], [38].
Proline là một axit amin ưa nước,được tổng hợp từ glutamin nhờ sự
xúc tác của enzyme delta-1-pyrroline-5-carboxylate sythetase (P5CS), có khối lượng phân tử nhỏ. Nó được tích lũy nhiều ở mô lá, mô phân sinh chóp rễ và ở hạt phấn khi thực vật bị mất nước [36].
Trong điều kiện stress phi sinh học, thực vật có xu hướng sản sinh proline, proline đóng vai trò như một chất điều hòa thẩm thấu, một chất chống oxy hóa và là một phân tử tín hiệu (Yaish MW (2015) [44].
Proline tự do có hiệu lực sinh học đa năng trong điều kiện stress môi trường. Chúng không chỉ có vai trò điều chỉnh áp suất thẩm thấu mà còn chống oxy hóa, tạo năng lượng để đảm bảo sự ổn định của tế bào giúp cơ thể thích nghi với môi trường mới.
Tác động chống oxy hóa của proline thể hiển ở khả năng chúng bảo vệ protein và màng khỏi tổn thương do chúng làm bất hoạt các nhóm hydroxyl và các chất phản ứng mạnh khác sinh ra khi cây gặp các stress trong ty thể và
lục lạp.
Proline ngoài vai trò quan trọng là điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào, axit amin này còn giúp giữ nước, lấy nước cho tế bào và ngăn chặn sự
xâm nhập của ion Na+
tương tác với protein màng, ngăn chặn sự phá hủy của màng và các phức protein khác [43].
1.3.3.2. Vai trò của các enzyme chống oxy hóa
Một trong những tác động điển hình của Pb đối với cây trồng là gây stress “oxy hóa” với sự hình thành mạnh mẽ các dạng oxy hoạt hóa (reactive oxygen species - ROS) nội sinh như hydrogen peroxide - H2O2, các gốc tự do superoxide - O2
•-
và hydroxyl - HO- (Wojtaszek, 1997; Bhattacharjee, 2005; Malecka et al., 2009). Sinh tổng hợp ROS thường gắn liền với các cơ chế cảm ứng kích thích những phản ứng của thực vật như: nhận diện yếu tố tác động, tăng cường độ bền của vách tế bào, khởi động các con đường tín hiệu, kích hoạt biểu hiện của gen và protein có chức năng bảo vệ,... (Mittler et al., 2004; Maffei et al., 2007; Radville et al., 2011). Tuy nhiên, ROS cũng gây độc đối với tế bào sống. Hàm lượng ROS cao thường làm rối loạn tính thấm của màng, đồng thời gây nên những biến đổi khó phục hồi đối với các thành phần quan trọng như lipid, protein, acid nucleic..., thậm chí gây chết tế bào (Ahmad et al., 2008) [21].
Để hạn chế những thiệt hại do stress “oxy hóa”, thực vật có những cơ chế kiểm soát, điều chỉnh hàm lượng ROS phù hợp, trong đó có sự tham gia của các enzyme chống ôxy hóa như superoxide dismutase, catalase, peroxidase và ascorbate peroxidase (Maffei et al., 2007; Ahmad et al., 2008). Các enzyme này vừa duy trì sinh tổng hợp ROS để tăng cường khả năng chống chịu trước tác động từ môi trường ngoài, đồng thời kiểm soát, giảm thiểu độc tính của ROS đối với các yếu tố cấu trúc và quá trình sống diễn ra bên trong tế bào [21], [33].
Superoxide dimutase (SOD) và vai trò của SOD: H2O và O2 là những yếu tố cần thiết để duy trì sự sống trong cơ thể. Nhưng dưới sự tác động của môi trường bất lợi, trong các hệ thống chuyển năng lượng và electron của tế bào thường tạo ra các gốc tự do. Các gốc tự do có khả năng oxy hóa rất mạnh, tác động lên protein, lipid…Vì vậy vấn đề loại bỏ gốc tự do trong tế bào là cơ chế bảo vệ có tính quyết định sự sống còn của tế bào. Một trong những enzyme tham gia vào quá trình đó là superoxide dimutase (SOD) [27].
Mc Cord và Fridovitch đã phát hiện SOD năm 1969. Họ đã nhận thấy đây chính là enzyme chủ chốt bảo vệ tế bào khỏi oxy hóa. SOD xúc tác phản ứng loại bỏ superoxide anion: 2 H+
+ O2-= H2O2 + O2 .
Ở thực vật bậc cao, SOD hoạt động như chất chống oxy hóa và bảo vệ các thành phần tế bào khỏi bị oxy hóa bởi các loại oxy phản ứng ROS. Cụ thể, phân tử O2 bị khử thành O2
-
(một loại ROS gọi là superoxide) khi nó hấp thụ một electron kích thích được giải phóng từ các hợp chất của chuỗi vận chuyển điện tử. SOD xúc tác tạo thành O2 và H2O2 từ superoxide (O2
-
), dẫn đến các chất phản ứng ít gây hại hơn. H2O2 tạo thành được biến đổi tiếp tục nhờ catalase và peroxidase. Hoạt tính của SOD tăng lên khi phản ứng với điều kiện bất lợi của môi trườngvà tăng theo mức độ stress [42].
Catalase (CAT) và vai trò của catalase: Catalase là “hem-enzyme”, mỗi phân tử của nó chứa 4 nhóm hem, xúc tác cho phản ứng chuyển H2O2
thành H2O và O2. Catalase có trong nhiều loại thực vật khác nhau, thậm chí trong cùng một loài. Các izozyme đều là tetramer có MW 220 kDa. Catalase là một enzyme quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi bị oxy hóa bới các loại oxy phản ứng [11].
Peroxidase (POD) và vai trò của peroxidase: là tập hợp gồm nhiều enzyme chống oxy hóa, có chức năng giải độc peroxide. Peroxidase đã được phân loại thành 3 loại (loại I, loại II và loại III). Enzyme peroxidase rất phổ biến trong cơ thể thực vật, có vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa.
Peroxidase xúc tác cho phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ khi có mặt của H2O2 và loại khả năng gây độc của H2O2, bảo vệ tế bào và cơ thể thực vật trước tác động của điều kiện bất lợi [11].
Ascorbate peroxydase (APX) và vai trò của APX ở thực vật: là một
thành viên của gia đình peroxidase có nhân heme. Peroxidase xúc tác quá trình oxy hóa các chất hữu cơ phụ thuộc H2O2. APX là enzyme peroxidase loại I, xúc tác quá trình oxy hóa phụ thuộc H2O2 của ascorbate trong thực vật, tảo và một số vi khuẩn lam.
Ở thực vật, có thể giải độc ROS nhờ vào một hệ thống khử độc hydro peroxide trong tế bào thực vật là chu trình ascorbate-glutathione. Trong đó, enzyme APX đóng vai trò chính, xúc tác cho quá trình chuyển H2O2 thành H2O, sử dụng ascorbate làm chất cho điện tử.
Sự biểu hiện của các gen mã hóa cho APX được điều hòa bởi các nhân tố môi trường khắc nghiệt chẳng hạn như hạn hán, mặn muối, nhiệt độ quá cao, quá thấp, acid abscisic…Các phản ứng xúc tác bởi APX liên quan trực tiếp đến việc bảo vệ tế bào thực vật chống lại các điều kiện môi trường bất lợi [22].
1.4. Tình hình nghiên cứu tính chống chịu kim loại Pb của cây đậu tƣơng
1.4.1. Nghiên cứu khả năng chống chịu kim loại Pb của cây đậu tương trên thế giới
Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã thành công khi nghiên cứu sâu hơn về tác động của kim loại chì và khả năng chống chịu kim loại Pb ở cây đậu tương. Nồng độ kim loại chì cao có tác dụng ức chế tỷ lệ nảy mầm hạt, chiều dài rễ, chiều dài chồi, chỉ số dung nạp, trọng lượng tươi khô của cây đậu tương.
Nồng độ kẽm và chì càng cao trong môi trường đất đã làm giảm mạnh năng suất cây trồng. Nghiên cứu này còn cho thấy dưới tác động của kim loại chì đã tạo ra nhiều oxy hoạt hóa, làm tăng hoạt độ của các enzyme chống oxy hóa [21].
1.4.2. Nghiên cứu tính chống chịu kim loại chì của cây đậu tương ở Việt Nam
Đã có một số nghiên cứu về khả năng chống chịu kim loại chì ở một số giống đậu tương. Năm 2014, Mai Văn Chung và cộng sự đã nghiên cứuvề phản ứng siêu nhạy cảm của rễ cây đậu tương Nam Đàn dưới ảnh hưởng của
ion chì (Pb2+) ở các nồng độ 0,1 mM, 0,5 mM và 1,0 mM sau 6 giờ. Kết quả
cho thấy đậu tương đã tổng hợp mạnh mẽ dạng ôxy hoạt hóa hydrogen peroxide, tăng phân giải lipid màng tế bào, tỷ lệ thương tổn tế bào cao. Các enzyme SOD và CAT duy trì độ hoạt động cao trong khoảng thời gian 6-48 giờ góp phần kiểm soát hàm lượng H2O2 và O2
.-
nội sinh trong phản ứng siêu nhạy cảm [5].
Mai Văn Chung, Trần Ngọc Toàn (2015) [6] đã nghiên cứu về stress “oxy hóa” và phản ứng bảo vệ của cây đậu tương DT84 đối với chì cho thấy ion Pb2+ đã gây stress “oxy hóa” ở rễ cây đậu tương DT84 với sự cảm ứng tổng hợp sớm và mạnh mẽ các dạng ôxy hoạt hóa nội sinh sau khi Pb2+ tác động 6 - 12 giờ. Sự tăng lên về hàm lượng các dẫn xuất của axit thiobarbituric - sản phẩm của quá trình peroxide hóa lipid màng, cùng với tỷ lệ tổn thương tế bào lớn (13,89-25,03%) là hậu quả của stress “ôxy hóa”. Các enzyme chống ôxy hóa superoxide dismutase và catalase có hoạt độ cao đã làm giảm lượng H2O2 và O2.- sau 24 giờ chịu tác động của Pb2+, góp phần kiểm soát stress “ôxy hóa” ở rễ đậu tương DT84.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu
Các giống đậu tương được dùng trong nghiên cứu bao gồm ĐTDH.10 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ nghiên cứu và chọn tạo; giống ĐTDH.04 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung bộ và Trung tâm Nghiên cứu và Phát Triển đậu đỗ phối hợp chọn lọc và giống MTĐ 176 do Trường Đại học Cần Thơ chọn lọc.
Kim loại chì (Pb) dùng để tác động đến cây đậu tương ở dạng ion Pb2+của muối chì nitrat -Pb(NO3)2.
Bảng 2.1. Đặc điểm nông học của các giống đậu tƣơng nghiên cứu
Đặc điểm ĐTDH.10 ĐTDH.04 MTĐ 176
Thời gian
sinh trƣởng 80 – 85 ngày 80 – 85 ngày 84 – 90 ngày Chiều cao cây 35 – 58 cm 55 – 65 cm 45 – 50 cm
Khối lƣợng
1000 hạt 163 – 183 g 168 – 185 g 170– 180 g Năng suất 27 – 35 tạ/ha 24,5 – 36,4 tạ/ha 20 – 25 tạ/ha
Khả năng chống chịu Kháng sâu cuốn lá, sâu đục quả và bệnh đốm lá, chống đổ ngã Kháng sâu cuốn lá, sâu đục quả và bệnh đốm lá, chống đổ ngã tốt Kháng được sâu cuốn lá, sâu đục thân, chịu phèn, chống đổ ngã tốt
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 7 năm 2019.
- Địa điểm: Các nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý-Hóa sinh và vườn Sinh học thuộc khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Quy Nhơn.
2.3. Hóa chất và thiết bị
2.3.1. Hóa chất và nguyên liệu khác
Ninhydrin, guaiacol được mua từ Merck (Đức); proline chuẩn, L- methionin, riboflavin, EDTA, acid ascorbic, chì –Pb(NO3)2, toluen được mua từ Biobasic (Canada); NBT được mua từ Sigma (Mỹ) và một số hóa chất khác…
2.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Một số thiết bị chính dùng trong thí nghiệm gồm máy ly tâm lạnh (Mikro 22R- Hattich, Đức), máy đo quang phổ (Pharmacia LKB – Ultraspec, Denmark), máy đo pH (Orion, USA), tủ lạnh (Sanyo, Nhật Bản), pipetman các loại (Gilso, Pháp), tủ sấy (Anh).
Một số dụng cụ khác như ống eppendof, bếp điện, bình tam giác, ống falcon 50 ml, 150 ml, ống đong 10 ml và 100 ml, bình tam giác, bình định mức, chày, cối, găng tay, khẩu trang, …
2.4. Nội dung nghiên cứu
- Xác định sự biến động hàm lượng proline và hàm lượng ascorbic của lá đậu tương trong quá trình gây nhiễm kim loại chì ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
- Xác định hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa bao gồm catalase, superoxide dismutase, peroxidase, ascorbate peroxidase của lá đậu tương trong quá trình gây nhiễm chì với các nồng độ khác nhau ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
(1) Thời kỳ cây non:
Hạt giống được khử trùng bởi etanol 70o, rồi ủ trong các đĩa petri có đủ độ ẩm, đặt trong tối ở nhiệt độ thích hợp. Sau 48 giờ, những hạt nảy mầm tốt được lựa chọn trồng trong chậu chứa cát sạch, chia các chậu thành các lô đối chứng và thí nghiệm. Số lượng cây/chậu là 15 cây, mỗi công thức lặp lại 3 lần.
Cây được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường, đến ngày thứ 7 sau khi gieo, cây có 2 lá thật thì lô thí nghiệm được bổ sung vào môi trường nuôi cây (dung dịch dinh dưỡng Hoagland) muối chì Pb(NO3)2 ở các nồng độ ion Pb2+: 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM. Công thức đối chứng không bổ sung Pb2+. Sau 1 tuần xử lý chì, thu mẫu lá và xác định hàm lượng proline, hàm lượng ascorbic; xác định hoạt độ superoxide dimutase, catalase, peroxidase và ascorbate peroxidase.
(2) Thời kỳ cây ra hoa, tạo quả:
Cây được chăm sóc bình thường đến thời điểm cây đậu tương bắt đầu ra hoa đầu tiên thì lô thí nghiệm sẽ tiến hành gây nhiễm chì với các nồng độ ion Pb2+: 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM; thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu sau 1 tuần gây nhiễm chì. Ở giai đoạn cây tạo quả, cách thức gây nhiễm chì cũng tương tự như giai đoạn ra hoa. Thời điểm bắt đầu gây nhiễm chì là giai đoạn chuẩn bị hình thành quả non.
2.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định
2.5.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng proline
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [23]. + Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden.
Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam. Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:
m = 5 115,5 C V P
Trong đó: m : hàm lượng proline (µg/g) C : nồng độ proline (µg/ml) V : Thể tích dung môi chiết (ml) P : Trọng lượng mẫu phân tích (g)
2.5.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng acid ascorbic
Hàm lượng ascorbic được xác định theo phương pháp chuẩn độ [3] + Nguyên tắc: Ascorbic có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi ascorbic có trong mẫu, suy ra hàm lượng ascorbic.
+ Tiến hành: Cân 5g lá tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml HCl 5%, nghiền kỹ, cho vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn đến vạch 50ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích 100 ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh và xác định hàm lượng ascorbic trong mẫu.
2.5.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme catalase
Hoạt độ enzyme catalase được xác định theo phương pháp dựa vào lượng peroxit bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme bằng cách chuẩn độ với
dung dịch KMnO4 theo phương pháp Bakh - Oparin [3].
X=( )
B - Số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm
V1 - Tổng thể tích dung dịch enzyme V2 - ml dung dịch enzyme lấy đi phân tích a - Số gam lá lấy đi nghiên cứu
Số đơn vị catalase trong 1g lá (micromol H2O2 bị phân giải sau 1 phút) là đơn vị
30 - Thời gian enzyme tác dụng tính bằng phút 0,034 – Micromol H2O2 (mg)
2.5.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme peroxidase
Hoạt độ enzyme peroxidase được xác định theo phương pháp của Malik và Singh (1980).
+ Nguyên tắc: POD sẽ xúc tác và oxi hóa hợp chất hữu cơ như phenol, amin có nhân thơm. Hoạt độ được xác định dựa trên sự oxi hóa guaiacol và guaiacol chính là cơ chất.
+ Tiến hành: Nghiền 1 g mẫu lá đậu tương trong 3 ml đệm photphat 0,1