2.5.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng proline
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [23]. + Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden.
Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam. Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:
m = 5 115,5 C V P
Trong đó: m : hàm lượng proline (µg/g) C : nồng độ proline (µg/ml) V : Thể tích dung môi chiết (ml) P : Trọng lượng mẫu phân tích (g)
2.5.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng acid ascorbic
Hàm lượng ascorbic được xác định theo phương pháp chuẩn độ [3] + Nguyên tắc: Ascorbic có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi ascorbic có trong mẫu, suy ra hàm lượng ascorbic.
+ Tiến hành: Cân 5g lá tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml HCl 5%, nghiền kỹ, cho vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn đến vạch 50ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích 100 ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh và xác định hàm lượng ascorbic trong mẫu.
2.5.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme catalase
Hoạt độ enzyme catalase được xác định theo phương pháp dựa vào lượng peroxit bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme bằng cách chuẩn độ với
dung dịch KMnO4 theo phương pháp Bakh - Oparin [3].
X=( )
B - Số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm
V1 - Tổng thể tích dung dịch enzyme V2 - ml dung dịch enzyme lấy đi phân tích a - Số gam lá lấy đi nghiên cứu
Số đơn vị catalase trong 1g lá (micromol H2O2 bị phân giải sau 1 phút) là đơn vị
30 - Thời gian enzyme tác dụng tính bằng phút 0,034 – Micromol H2O2 (mg)
2.5.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme peroxidase
Hoạt độ enzyme peroxidase được xác định theo phương pháp của Malik và Singh (1980).
+ Nguyên tắc: POD sẽ xúc tác và oxi hóa hợp chất hữu cơ như phenol, amin có nhân thơm. Hoạt độ được xác định dựa trên sự oxi hóa guaiacol và guaiacol chính là cơ chất.
+ Tiến hành: Nghiền 1 g mẫu lá đậu tương trong 3 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,0. Ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút ở 4°C. Lấy dịch trong làm nguồn enzyme. Hút 3 ml dung dịch đệm photphat, thêm vào 0,05 ml dung dịch guaiacol có nồng độ 20 mM; thêm 0,1 ml dịch chiết enzyme, sau đó cho 0,03 ml H2O2 0,042%. Lắc kỹ hỗn hợp, đo quang phổ ở bước sóng 436 nm.
2.5.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme superoxide dismutase
Hoạt độ enzyme superoxide dismutase được phân tích bằng phương pháp Dhindsa (1981) [27].
+ Nguyên tắc: Nitroblue tetrazolium (NBT) bị khử khi tiếp xúc ánh sáng bởi các gốc superoxide, NBT cạnh tranh với SOD về anion superoxide. Sự có mặt của SOD trong hỗn hợp phản ứng NBT sẽ tạo ra lượng phức chất màu ít hơn đối chứng. 1 đơn vị hoạt độ SOD được xác định là lượng enzyme
cần thiết ức chế 50% NBT khử ở 560 nm.
+ Tiến hành: Nghiền lạnh 0,5 g lá đậu tương trong 1,5 ml đệm photphat 0,2 M, pH 7,0. Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 4°C. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,05 ml dịch enzyme, 0,2 ml methionine 200 mM; 0,1 ml EDTA 3 mM; 0,1 ml NBT 2,25 mM; 1,5 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,5; 1 ml nước cất; 0,1 ml Na2CO3 1,5 M; 0,1ml riboflavin 60 µM. Hỗn hợp tiếp xúc với ánh sáng đèn huỳnh quang 15W trong 15 phút, xuất hiện phức chất màu xanh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 560 nm.
2.5.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ascorbate peroxidase
Hoạt độ enzyme ascorbate peroxidase được xác định theo phương pháp của Nakano và Asada (1981).
+ Nguyên tắc: Ascorbate peroxidase xúc tác cho phản ứng khử H2O2, sử dụng cơ chất là acid ascorbic. 1 mol H2O2 oxy hóa 1 mol ascorbic thành 1 mol dehydro ascorbic. Tốc độ oxy hóa ascorbic được tính dựa vào việc giảm độ hấp thụ ở 290 nm. 1 đơn vị APX được xác định là lượng enzyme cần thiết oxi hóa 1 µmol acid ascorbic trong 1 phút.
+ Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1,5 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,5; 0,3 ml acid ascorbic 0,5 mM; 0,6 ml dịch enzyme; 0,6 ml H2O2 0,2 mM. Độ giảm hấp thụ được đo trong 3 phút với khoảng cách thời gian 30 giây.