- Xác định sự biến động hàm lượng proline và hàm lượng ascorbic của lá đậu tương trong quá trình gây nhiễm kim loại chì ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
- Xác định hoạt độ một số enzyme chống oxy hóa bao gồm catalase, superoxide dismutase, peroxidase, ascorbate peroxidase của lá đậu tương trong quá trình gây nhiễm chì với các nồng độ khác nhau ở thời kỳ cây non, ra hoa và tạo quả.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
(1) Thời kỳ cây non:
Hạt giống được khử trùng bởi etanol 70o, rồi ủ trong các đĩa petri có đủ độ ẩm, đặt trong tối ở nhiệt độ thích hợp. Sau 48 giờ, những hạt nảy mầm tốt được lựa chọn trồng trong chậu chứa cát sạch, chia các chậu thành các lô đối chứng và thí nghiệm. Số lượng cây/chậu là 15 cây, mỗi công thức lặp lại 3 lần.
Cây được đảm bảo chế độ chăm sóc thông thường, đến ngày thứ 7 sau khi gieo, cây có 2 lá thật thì lô thí nghiệm được bổ sung vào môi trường nuôi cây (dung dịch dinh dưỡng Hoagland) muối chì Pb(NO3)2 ở các nồng độ ion Pb2+: 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM. Công thức đối chứng không bổ sung Pb2+. Sau 1 tuần xử lý chì, thu mẫu lá và xác định hàm lượng proline, hàm lượng ascorbic; xác định hoạt độ superoxide dimutase, catalase, peroxidase và ascorbate peroxidase.
(2) Thời kỳ cây ra hoa, tạo quả:
Cây được chăm sóc bình thường đến thời điểm cây đậu tương bắt đầu ra hoa đầu tiên thì lô thí nghiệm sẽ tiến hành gây nhiễm chì với các nồng độ ion Pb2+: 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM; thu mẫu lá để phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu sau 1 tuần gây nhiễm chì. Ở giai đoạn cây tạo quả, cách thức gây nhiễm chì cũng tương tự như giai đoạn ra hoa. Thời điểm bắt đầu gây nhiễm chì là giai đoạn chuẩn bị hình thành quả non.
2.5.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu và phương pháp xác định
2.5.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng proline
Hàm lượng proline được xác định theo phương pháp Bates (1973) [23]. + Nguyên tắc: Khi proline phản ứng với thuốc thử ninhydrin ở nhiệt độ cao, proline bị oxi hóa còn ninhydrin bị khử tạo thành dixeto oxihindriden.
Sản phẩm tiếp tục phản ứng với một phần tử ninhydrin thứ hai tạo thành hợp chất có màu vàng da cam. Hỗn hợp phản ứng được tách chiết bằng dung dịch toluen, so màu ở bước sóng 520 nm. Đối chiếu với đồ thị chuẩn proline, xác định được hàm lượng proline trong mẫu thí nghiệm và tính toán theo trọng lượng tươi như sau:
m = 5 115,5 C V P
Trong đó: m : hàm lượng proline (µg/g) C : nồng độ proline (µg/ml) V : Thể tích dung môi chiết (ml) P : Trọng lượng mẫu phân tích (g)
2.5.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng acid ascorbic
Hàm lượng ascorbic được xác định theo phương pháp chuẩn độ [3] + Nguyên tắc: Ascorbic có thể khử dung dịch iot. Dựa vào lượng iot bị khử bởi ascorbic có trong mẫu, suy ra hàm lượng ascorbic.
+ Tiến hành: Cân 5g lá tươi, nghiền nhỏ trong cối sứ với 5ml HCl 5%, nghiền kỹ, cho vào ống đong (hoặc bình định mức), dẫn đến vạch 50ml bằng nước cất. Khuấy đều, lấy 20ml dịch nghiền cho vào bình nón dung tích 100 ml, chuẩn độ bằng dung dịch I2 có tinh bột làm chỉ thị màu cho đến màu xanh và xác định hàm lượng ascorbic trong mẫu.
2.5.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme catalase
Hoạt độ enzyme catalase được xác định theo phương pháp dựa vào lượng peroxit bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme bằng cách chuẩn độ với
dung dịch KMnO4 theo phương pháp Bakh - Oparin [3].
X=( )
B - Số ml KMnO4 0,1N đã dùng để chuẩn độ H2O2 còn lại trong bình thí nghiệm
V1 - Tổng thể tích dung dịch enzyme V2 - ml dung dịch enzyme lấy đi phân tích a - Số gam lá lấy đi nghiên cứu
Số đơn vị catalase trong 1g lá (micromol H2O2 bị phân giải sau 1 phút) là đơn vị
30 - Thời gian enzyme tác dụng tính bằng phút 0,034 – Micromol H2O2 (mg)
2.5.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme peroxidase
Hoạt độ enzyme peroxidase được xác định theo phương pháp của Malik và Singh (1980).
+ Nguyên tắc: POD sẽ xúc tác và oxi hóa hợp chất hữu cơ như phenol, amin có nhân thơm. Hoạt độ được xác định dựa trên sự oxi hóa guaiacol và guaiacol chính là cơ chất.
+ Tiến hành: Nghiền 1 g mẫu lá đậu tương trong 3 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,0. Ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút ở 4°C. Lấy dịch trong làm nguồn enzyme. Hút 3 ml dung dịch đệm photphat, thêm vào 0,05 ml dung dịch guaiacol có nồng độ 20 mM; thêm 0,1 ml dịch chiết enzyme, sau đó cho 0,03 ml H2O2 0,042%. Lắc kỹ hỗn hợp, đo quang phổ ở bước sóng 436 nm.
2.5.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme superoxide dismutase
Hoạt độ enzyme superoxide dismutase được phân tích bằng phương pháp Dhindsa (1981) [27].
+ Nguyên tắc: Nitroblue tetrazolium (NBT) bị khử khi tiếp xúc ánh sáng bởi các gốc superoxide, NBT cạnh tranh với SOD về anion superoxide. Sự có mặt của SOD trong hỗn hợp phản ứng NBT sẽ tạo ra lượng phức chất màu ít hơn đối chứng. 1 đơn vị hoạt độ SOD được xác định là lượng enzyme
cần thiết ức chế 50% NBT khử ở 560 nm.
+ Tiến hành: Nghiền lạnh 0,5 g lá đậu tương trong 1,5 ml đệm photphat 0,2 M, pH 7,0. Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 4°C. Hỗn hợp phản ứng gồm 0,05 ml dịch enzyme, 0,2 ml methionine 200 mM; 0,1 ml EDTA 3 mM; 0,1 ml NBT 2,25 mM; 1,5 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,5; 1 ml nước cất; 0,1 ml Na2CO3 1,5 M; 0,1ml riboflavin 60 µM. Hỗn hợp tiếp xúc với ánh sáng đèn huỳnh quang 15W trong 15 phút, xuất hiện phức chất màu xanh. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 560 nm.
2.5.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme ascorbate peroxidase
Hoạt độ enzyme ascorbate peroxidase được xác định theo phương pháp của Nakano và Asada (1981).
+ Nguyên tắc: Ascorbate peroxidase xúc tác cho phản ứng khử H2O2, sử dụng cơ chất là acid ascorbic. 1 mol H2O2 oxy hóa 1 mol ascorbic thành 1 mol dehydro ascorbic. Tốc độ oxy hóa ascorbic được tính dựa vào việc giảm độ hấp thụ ở 290 nm. 1 đơn vị APX được xác định là lượng enzyme cần thiết oxi hóa 1 µmol acid ascorbic trong 1 phút.
+ Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng bao gồm 1,5 ml đệm photphat 0,1 M, pH 7,5; 0,3 ml acid ascorbic 0,5 mM; 0,6 ml dịch enzyme; 0,6 ml H2O2 0,2 mM. Độ giảm hấp thụ được đo trong 3 phút với khoảng cách thời gian 30 giây.
2.5.3. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học qua các thông số: giá trị trung bình mẫu, độ lệch chuẩn, sai số trung bình. Sử dụng phần mềm MS Excel và Statistix. Các công thức toán thống kê được sử dụng:
+ Giá trị trung bình mẫu X :
n i i x n X 1 1
xi: giá trị đo đếm ở mỗi lần nhắc lại
+ Phương sai mẫu Sx2: 2
1 2 ) ( 1 X X n S n i i x + Độ lệch tiêu chuẩn Sx : n X X S n i i x 1 2 ) ( với n ≥ 30
Sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các nghiệm thức được đánh giá theo phân tích ANOVA với mức ý nghĩa p <0,05.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 3.1. Sự biến động hàm lƣợng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì
3.1.1. Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì ở giai đoạn cây non
Acid ascorbic là một trong những hợp chất chống oxy hóa có trong các mô thực vật, tan trong nước. Acid ascorbic có khả năng khử các gốc tự do tạo ra dưới áp lực stress. Vì vậy acid ascorbic có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây đậu tương trong điều kiện nhiễm kim loại nặng.
Hàm lượng acid ascorbic của 3 giống đậu tương trong quá trình gây nhiễm chì ở giai đoạn cây non được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lƣợng acid ascorbic trong lá đậu tƣơng ở giai đoạn cây non trong môi trƣờng nhiễm chì
Giống CTTN Hàm lƣợng ascorbic (%) Sau 1 tuần % so ĐC ĐTDH.10 ĐC 0,81cd ± 0,006 100,00 0,1 mM 0,83c ± 0,010 102,47 0,5 mM 0,89a ± 0,012 109,88 1,0 mM 0,91a ± 0,010 112,35 MTĐ 176 ĐC 0,79e ± 0,006 100,00 0,1 mM 0,80ed ± 0,010 101,27 0,5 mM 0,85b ± 0,015 107,60 1,0 mM 0,86b ± 0,015 108,86 ĐTDH.04 ĐC 0,75f ± 0,010 100,00 0,1 mM 0,76f ± 0,006 101,33 0,5 mM 0,79e ± 0,006 105,33 1,0 mM 0,80ed ± 0,015 106.67 CV(%) 1,3 LSD0,05 0,018
Ghi chú: Trong cùng một cột những số khác mẫu tự theo sau khác biệt nhau ở mức ý nghĩa 5%
Kết quả bảng 3.1 cho thấy nồng độ chì đã tác động đến hàm lượng acid ascorbic của lá đậu tương ở giai đoạn cây non. Cụ thể như sau, trong cùng một giống ĐTDH.10 ở nồng độ gây nhiễm chì là 0,1 mM thì hàm lượng acid ascorbic tăng 2,47%, ở nồng độ chì là 0,5 mM thì hàm lượng acid ascorbic tăng 9,88%, ở nồng độ chì 1,0 mM thì hàm lượng acid ascorbic tăng 12,35% so với đối chứng. Đối với giống MTĐ 176 thì hàm lương acid ascorbic cũng tăng dần theo nồng độ nhiễm chì, ở nồng độ 0,1 mM thì hàm lượng acid ascorbic là 1,27%, ở nồng độ chì 0,5 mM thì hàm lượng acid ascorbic tăng đạt được là 7,6%, ở nồng độ 1,0 mM thì hàm lượng ascorbic tăng đạt được là 8,86%. Giống ĐTDH.04 có hàm lượng acid ascorbic cũng tăng theo từng nồng độ nhiễm chì 0,1 mM; 0,5 mM và 1,0 mM lần lượt là 1,33%;5,33% và 6,67% so với đối chứng. Trong điều kiện nghiên cứu, nồng độ chì tăng dần thì hàm lượng acid ascorbic cũng tăng dần theo nồng độ và cao nhất ở nồng độ chì 1 mM. Tuy nhiên, không có sai khác nhiều về hàm lượng ascorbic ở giống ĐTDH.10 và ĐTDH.04 khi xử lý chì 0,5 mM và 1 mM (thể hiện qua xử lý thống kê).
Yếu tố giống cũng ảnh hưởng đến hàm lượng acid ascorbic. Sau khi nhiễm chì, tại nồng độ 0,1 mM thì giống ĐTĐH.10 có hàm lượng tăng 2,47%, giống MTĐ 176 tăng 1,27%, còn giống ĐTDH.04 tăng 1,33%. Ở nồng độ 0,5 mM, các giống ĐTDH.10, MTĐ 176, ĐTDH.04 có hàm lượng acid ascorbic tăng lần lượt theo thứ tự là 9,88%; 7,6% và 5,33% so với đối chứng. Ở nồng độ 1,0 mM, các giống cũng tăng hàm lượng acid ascorbic theo thứ tự ĐTDH.10, MTĐ 176, ĐTDH.04 là 12,35%; 8,86% và 6,67% so với đối chứng. Chúng tôi nhận thấy ở từng nồng độ chì nghiên cứu, hàm lượng acid ascorbic tăng so với đối chứng, cao nhất là ĐTDH.10, tiếp theo là MTĐ 176 và tăng ít nhất là ĐTDH.04.
Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương ở giai đoạn cây non được thể hiện ở đồ thị 3.1.
Đồ thi 3.1. Sự biến động hàm lƣợng acid ascorbic trong lá đậu tƣơng ở giai đoạn cây non trong môi trƣờng nhiễm chì
3.1.2. Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì ở giai đoạn ra hoa ở giai đoạn ra hoa
Bảng 3.2. Hàm lƣợng acid ascorbic trong lá đậu tƣơng ở giai đoạn ra hoa trong môi trƣờng nhiễm chì Giống CTTN Hàm lƣợng ascorbic (%) Sau 1 tuần % so ĐC ĐTDH.10 ĐC 0,82def ± 0,006 100,00 0,1 mM 0,84cd ±0,015 102,44 0,5 mM 0,90a ± 0,015 109,76 1,0 mM 0,91a ± 0,010 110,98 MTĐ 176 ĐC 0,80f ± 0,006 100,00 0,1 mM 0,81ef ± 0,010 101,25 0,5 mM 0,86bc ± 0,015 107,50 1,0 mM 0,87b ± 0,020 108,75 ĐTDH.04 ĐC 0,76g ± 0,006 100,00 0,1 mM 0,77g ± 0,010 101,32 0,5 mM 0,81ef ± 0,017 106,58 1,0 mM 0,82de ± 0,012 107,89 CV(%) 1,53 LSD0,05 0,0214
Ghi chú: Trong cùng một cột những số khác mẫu tự theo sau khác biệt ở mức ý nghĩa 5% 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 ĐC 0,1 0,5 1,0 Hàm lƣợng acid asco rb ic Nồng độ chì nitrat Pb 2+ ĐTDH.10 MTĐ 176 ĐTDH.04
Qua kết quả phân tích số liệu, hàm lượng acid ascorbic của lá đậu tương ở giai đoạn ra hoa cũng bị ảnh hưởng bởi yếu tố giống và nồng độ chì. Hàm lượng acid ascorbic của 3 giống nghiên cứu ở giai đoạn này đều tăng sau một tuần nhiễm chì so với đối chứng.
Trong điều kiện nghiên cứu, nồng độ chì tăng dần thì hàm lượng acid ascorbic cũng tăng dần. Tuy nhiên ở nồng độ chì 0,1 mM thì sự biến động này không đáng kể. Ở nồng độ 0,5 mM, giống ĐTDH.10 tăng 9,76% so với đối chứng, tiếp đến giống MTĐ 176 tăng 7,5% so với đối chứng, giống ĐTDH.04 tăng 6,58% so với đối chứng. Ở nồng độ 1 mM, giống ĐTDH.10 tăng cao nhất, tăng 10,98% so với đối chứng, tiếp đến giống MTĐ 176 tăng ít hơn là 8,75% so với đối chứng, giống ĐTDH.04 tăng ít nhất, tăng 7,89% so với đối chứng. Từ nồng độ 0,5 mM đến 1,0 mM, không có sự sai khác về hàm lượng ascorbic giữa các công thức thí nghiệm của cùng 1 giống (khác biệt không có ý nghĩa thống kê).
Hàm lượng acid ascorbic trong lá đậu tương ở giai đoạn ra hoa trong môi trường nhiễm chì được thể hiện ở đồ thị 3.2.
Đồ thị 3.2. Sự biến động hàm lƣợng acid ascorbic trong lá đậu tƣơng ở giai đoạn ra hoa trong môi trƣờng nhiễm chì
0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 ĐC 0,1 0,5 1,0 H àm lƣợn g aci d asc orbi c Nồng độ chì nitrat Pb2+ ĐTDH.10 MTĐ 176 ĐTDH.04
3.1.3. Sự biến động hàm lượng acid ascorbic trong quá trình gây nhiễm chì ở giai đoạn cây tạo quả ở giai đoạn cây tạo quả
Hàm lượng acid ascorbic trong giai đoạn tạo quả được trình bày trong bảng 3.3 và đồ thị 3.3.
Bảng 3.3. Hàm lƣợng acid ascorbic trong lá cây đậu tƣơng ở giai đoạn tạo quả trong môi trƣờng nhiễm chì Giống CTTN Hàm lƣợng ascorbic (%) Sau 1 tuần % so ĐC ĐTDH.10 ĐC 0,81c ± 0,010 100,00 0,1 mM 0,82bc ± 0,006 102,23 0,5 mM 0,87a ± 0,012 107,41 1,0 mM 0,89a ± 0,010 109,88 MTĐ 176 ĐC 0,78de ± 0,006 100,00 0,1 mM 0,79d ± 0,010 101,28 0,5 mM 0,83bc ± 0,015 106,41 1,0 mM 0,84b ± 0,010 107,69 ĐTDH.04 ĐC 0,73f ± 0,010 100,00 0,1 mM 0,74f ± 0,006 101,37 0,5 mM 0,77e± 0,015 105,48 1,0 mM 0,78de ± 0,006 106,85 CV(%) 1,26 LSD0,05 0,0171
Ghi chú: Trong cùng một cột những số khác mẫu tự theo sau khác biệt nhau ở mức ý nghĩa 5%
Kết quả phân tích cho thấy rằng, nồng độ chì trong nghiên cứu của chúng tôi đã ảnh hưởng đến hàm lượng acid ascorbic theo quy luật tương tự như giai đoạn cây non và ra hoa. Ở nồng độ chì 0,1 mM, không có sự biến động nhiều giữa công thức thí nghiệm và đối chứng. Ở nồng độ 0,5 mM thì giống ĐTDH.10 tăng 7,41% so với đối chứng, giống MTĐ 176 tăng 6,41% so với đối chứng, giống ĐTDH.04 tăng ít hơn là 5,48% so với đối chứng. Ở nồng độ 1,0 mM thì cả ba giống tiếp tục tăng nhưng không nhiều, giống ĐTDH.10 tăng 9,88% so với đối chứng, giống MTĐ 176 có hàm lượng acid
ascorbic tăng là 7,69% so với đối chứng, giống ĐTDH.04 thì tăng là 6,85% so với đối chứng. Sự biến động hàm lượng ascorbic ở nồng độ 0,5 mM đến 1,0 mM cũng tương tự như giai đoạn ra hoa đó là không có sự sai khác nhiều về hàm lượng ascorbic giữa các công thức thí nghiệm của cùng một giống (khác biệt không có ý nghĩa thống kê).
Sự biến động hàm lượng acid ascorbic của đậu tương ở giai đoạn tạo quả trong môi trường nhiễm chì thể hiện qua đồ thị 3.3.
Đồ thị 3.3. Sự biến động hàm lƣợng acid ascorbic trong lá đậu tƣơng ở giai đoạn tạo quả trong môi trƣờng nhiễm chì
Sự tăng hàm lượng acid ascosbic trong môi trường nhiễm chì cho thấy đậu tương phản ứng mạnh mẽ trước điều kiện bất lợi của môi trường. Kim loại chì ảnh hưởng rất lớn đến sự tổng hợp acid ascorbic ở các giống đậu tương và mức độ ảnh hưởng phụ thuộc vào đặc điểm của từng giống. Giống nào có khả năng chống chịu tốt với môi trường nhiễm kim loại nặng thì hàm lượng acid ascorbic tăng mạnh hơn so với các giống chống chịu kém hơn.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 ĐC 0,1 0,5 1,0 H àm lƣợn g aci d asc orbi c Nộng độ chì nitrat Pb2+ ĐTDH.10 ĐMTĐ 176 ĐTDH.04
3.2. Sự biến động hàm lƣợng proline của đậu tƣơng trong quá trình gây