8. Cấu trúc luận văn
2.2.1. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 9/2018 đến tháng 7/2019.
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Thời gian nghiên cứu
Phòng thí nghiệm khoa Côn Trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Tiến hành kỹ thuật nuôi muỗi trong phòng thí nghiệm cho muỗi đốt máu trực tiếp trên chuột và có sử dụng hệ thống màng cho ăn nhân tạo từ máy Hemotek, thực hiện trên 3 loại màng: màng Hemotek, màng ruột heo, màng parafilm.
- Đánh giá khả năng sinh sản của muỗi Aedes và Anopheles.
- Tỷ lệ muỗi đốt máu no khi cho đốt máu qua các loại màng và đốt trực tiếp trên chuột.
- Xác định chu kỳ tiêu sinh của muỗi Aedes và Anopheles.
Theo dõi và ghi lại thời gian đốt máu, tiêu máu và phát triển trứng của các loài muỗi Aedes và Anopheles.
- Tỷ lệ nở trứng của muỗi Aedes và Anopheles. - Thời gian sống của muỗi Aedes và Anopheles.
- So sánh hiệu quả sử dụng máy Hemotek trên 3 loại màng: Màng Hemotek, màng ruột heo, màng Parafilm.
- So sánh khả năng sinh sản, tỷ lệ nở trứng, thời gian sống khi cho muỗi đốt máu chuột và khi cho muỗi ăn bằng hệ thống máy Hemotek.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thử nghiệm với các phương pháp cho muỗi ăn khác nhau
- Muỗi được nuôi trong các lồng vải tuyn trắng, kích thước 30 x 30 x 30 cm. Mỗi lồng muỗi được cho ăn bằng 3 cách: đốt chuột trực tiếp, đốt qua màng Hemotek và màng ruột heo. Cho muỗi đốt liên tục 3giờ/ lần, ngày hai lần: sáng từ 8 giờ đến 11 giờ, chiều từ 2 giờ đến 5 giờ.
- Màng Hemotek là màng được làm bằng các sợi collagen tổng hợp, được phân phối đi kèm với hệ thống máy Hemotek. Màng ruột heo là phần ruột non của heo đã được xử lý bề mặt. Hàng ngày theo dõi sự thu hút của muỗi qua các phương pháp cho đốt khác nhau, so sánh để xác định loại màng nào thích hợp nhất có thể thay thế cho việc muỗi đốt trực tiếp trên chuột bạch.
2.4.2. Theo dõi sự ảnh hưởng của các phương pháp cho ăn khác nhau lên các giai đoạn phát triển của muỗi các giai đoạn phát triển của muỗi
Đếm số lượng muỗi đốt máu, số muỗi đẻ trứng, số trứng nở thành bọ gậy, số bọ gậy nở thành quăng, số quăng nở thành muỗi trưởng thành, đếm số lượng muỗi đực, cái, so sánh để xác định phương pháp cho đốt qua màng nào có khả năng sinh sản tốt, cho số lượng cao và khả năng sống sót lâu hơn để có thể thay thế phương pháp cho đốt trực tiếp trên chuột.
2.5. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
2.5.1. Phương pháp xác định khả năng sinh sản
- Thả khoảng 400 muỗi mới nở vào lồng 30 30 30cm tỉ lệ đực/cái (1/1). Sau 3 ngày cho muỗi đốt máu. Khoảng 4 - 5 ngày tiếp theo, bắt 10 muỗi cái ngẫu nhiên trong lồng, nhốt riêng vào từng ống đẻ, theo dõi số lần đẻ và số trứng mỗi lần đẻ của muỗi cái (lặp lại 3 lần).
bằng tổng số trứng thu được của quá trình sinh sản của tất cả muỗi trên tổng số muỗi theo dõi.
- Số trứng trung bình của muỗi cái trong một lần đẻ được tính bằng số lượng trứng trung bình của muỗi cái trong cả vòng đời trên số lần đẻ trứng trung bình của muỗi cái.
2.5.2. Phương pháp xác định tỷ lệ trứng nở
- Tỷ lệ trứng nở là số bọ gậy thu được trên tổng số trứng theo dõi.
Tỷ lệ trứng nở = số bọ gậy thu được
tổng số trứng ˣ 100
- Khi bọ gậy lột xác thành quăng, đếm số quăng, nhặt vào cốc thủy tinh và cho vào lồng, hàng ngày đếm và ghi lại số muỗi nở từng quăng.
- Tỷ lệ bọ gậy lột xác thành quăng là tỷ lệ giữa số quăng thu được trên tổng số bọ gậy theo dõi.
Tỷ lệ bọ gậy nở thành quăng = số quăng thu được
tổng số bọ gậy theo dõi ˣ 100
- Tỷ lệ quăng lột xác thành muỗi là tỷ lệ giưa tổng số muỗi thu được trên tổng số quăng theo dõi.
Tỷ lệ quăng nở thành muỗi = số muỗi thu được
tổng số quăng theo dõi ˣ 100
2.5.3. Phương pháp xác định thời gian sống
- Thả 50 muỗi đực và 50 muỗi cái mới nở vào lồng. Cho muỗi hút đường glucose 10% và đốt máu.
- Hàng ngày đếm và ghi lại số muỗi đực, cái chết cho đến khi hết số muỗi trong lồng.
2.5.4. Công thức tính chu kỳ sinh thực
Theo lý thuyết chu kì sinh thực của muỗi được tính bằng công thức l = 37
Trong đó: t là nhiệt độ trung bình của môi trường hàng ngày. 37 là tổng lượng nhiệt hữu hiệu
1 ngày là khoảng thời dành cho muỗi đẻ và tìm mồi để đốt.
90 C là nhiệt độ tối thiểu để muỗi phát triển. Muỗi là động vật biến nhiệt, nếu nhiệt độ môi trường > 400 C hoặc < 90 C thì muỗi sẽ bị chết.
2.5.5. Kỹ thuật nuôi bọ gậy, muỗi Aedes (Ae. aegypti, Ae. albopictus)
- Kỹ thuật nuôi bọ gậy Aedes
Mục đích của kỹ thuật: nhầm nhân rộng chủng bọ gậy thu thập ngoài thực địa, có 2 chủng bọ gậy muỗi Aedes được sử dụng trong nghiên cứu. Chủng thứ nhất là chủng bọ gậy được nuôi tại phòng thí nghiệm khoa Côn Trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn (chủng labo). Chủng này được nuôi trong labo từ năm 2000 và được xem là chủng nhạy. Chủng thứ hai là thu thập ngoài tự nhiên tại các địa điểm Quy Nhơn, Tuy Phước và Phù Cát (chủng thực địa). Bọ gậy sau khi thu thập tại các điểm nghiên cứu sẽ được đem về phòng thí nghiệm khoa Côn Trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn tiếp tục nuôi giữ để phát triển lên muỗi (F0), sau đó cho muỗi (F0) đốt máu chuột hoặc thỏ để đẻ trứng, phát triển thành bọ gậy (F1), loăng quăng, muỗi (F1). Nếu số lượng cá thể bọ gậy thu thập ngoài thực địa không đủ để tiến hành thử nghiệm thì có thể sử dụng chủng bọ gậy thế hệ (F1) nuôi trong phòng thí nghiệm làm chủng thực địa sử dụng cho thử nghiệm [4].
Vật liệu
+ Lồng nuôi muỗi có kích thước 40x40x40 cm.
+ Đĩa cho muỗi đẻ: Dùng đĩa Petri có phủ một lớp bông thấm nước, bên trên đặt một tờ giấy thấm Whatman.
+ Khay men cao 12cm, đường kính 50cm hoặc khay nhựa nuôi bọ gậy có kích thước 25 x 30 x 6 cm.
+ Chén đựng quăng.
+ Ly giấy có vải màn phủ kín. + Ống hút muỗi
+ Ống nghiệm bằng thuỷ tinh đựng ether gây mê muỗi. + Kính lúp.
+ Ether.
+ Bông thấm nước.
+ Thức ăn cho bọ gậy: Gan, men Saccaroza, bột tôm, bột đậu xanh, bột bánh mì.
Quy trình nuôi bọ gậy Aedes [4] Trứng
Thu thập trong bát bằng nhựa sâu 12 cm và đường kính 20 cm, mực nước chứa trong bát khoảng 6-8 cm, xung quanh lót bằng giấy thấm Whatman cho muỗi đẻ. Sau 1-2 ngày thu trứng trên giấy thấm. Trứng của Aedes có thể giữ từ 2 tuần đến 6 tháng. Thả trứng vào trong nước, sau 1-24 giờ trứng nở bọ gậy.
Bọ gậy
Nuôi bọ gậy trong khay men, mỗi khay thả từ 300 - 500 bọ gậy. Trong thời gian đầu khi bọ gậy đang ở tuổi 1 mực nước trong khay khoảng 3-5 cm, khi bọ gậy sang tuổi 2,3,4 tăng dần lượng nước trong khay.
Thức ăn: Bọ gậy tuổi I ăn nước bột gan, bột tôm hoà tan, mỗi ngày cho bọ
gậy ăn 2 lần. Khi bọ gậy sang tuổi 2 có thể ăn hỗn hợp ngày 4 lần, số lượng thức ăn, số lần ăn tăng khi bọ gậy sang tuổi 4 (không cho bọ gậy ăn nhiều vì thức ăn thừa sẽ làm hỏng nước nuôi). Dùng đầu tăm lấy thức ăn cho bọ gậy để không quá lượng quy định.
Trong trường hợp nước nuôi bọ gậy bẩn, có thể thay nước cho bọ gậy hoặc dùng ống hút hút chất bẩn ra.
tuyệt đối không nhiễm hoá chất và các vi sinh vật kí sinh. Nên dùng nước uống tinh khiết để nuôi bọ gậy, có thể dùng nước máy nhưng phải để 3-5 ngày cho chloramin trong nước bay hơi.
Thức ăn cho bọ gậy:
+ Gan gà, gan vịt luộc, sấy khô, xay mịn để đảm bảo thức ăn nổi trên nước. + Tôm tươi hấp chín, sấy khô, xay mịn.
+ Men saccaroza.
+ Trộn hỗn hợp trên với tỉ lệ 1:1:1.
Quăng
+ Dùng ống hút có miệng rộng để nhặt quăng từ khay nuôi bọ gậy cho vào chén. Đặt các chén này vào lồng muỗi.
+ Sau 2 -3 ngày quăng lột xác thành muỗi, lấy các chén ra.
Muỗi
+ Dùng một miếng bọt biển tẩm dung dịch đường Glucoza 10% và polyvitamin đặt vào trong lồng nuôi muỗi. Thay bọt biển 2 ngày 1lần.
+ Đặt bát nhựa xung quang có lót giấy thấm Whatman cho muỗi đẻ. - Kỹ thuật nuôi muỗi Aedes
Vật liệu:
+ Lồng nuôi muỗi có kích thước 40x40x40 cm.
+ Đĩa cho muỗi đẻ: Dùng đĩa Petri có phủ một lớp bông thấm nước, bên trên đặt một tờ giấy thấm Whatman.
+ Khay men cao 12cm, đường kính 50cm hoặc khay nhựa nuôi bọ gậy có kích thước :5 x 30 x 6 cm.
+ Ống hút để thu thập bọ gậy, quăng. + Chén đựng quăng.
+ Ly giấy có vải màn phủ kín. + Ống hút muỗi.
+ Ống nghiệm bằng thuỷ tinh đựng ether gây mê muỗi. + Kính lúp.
+ Ether.
+ Bông thấm nước.
Quy trình nuôi muỗi Aedes Trứng
+Đặt 1-2 đĩa Petri có bông thấm nước và giấy thấm cho muỗi đẻ vào lồng nuôi muỗi có muỗi cái sắp đẻ. Chú ý giữ cho giấy thấm luôn luôn ẩm.
+Sau 1-2 ngày thu trứng trên giấy thấm.
Bọ gậy
+ Thả bọ gậy phù hợp tùy theo kích thước của khay. Trong thời gian đầu khi bọ gậy đang ở tuổi 1 mức nước trong khay không quá 3cm, khi bọ gậy sang tuổi 2, 3, 4 tăng dần lượng nước trong khay.
+Thức ăn: Bọ gậy tuổi 1 ăn nước bột gan, bột tôm hòa tan, mỗi ngày cho bọ gậy ăn 2 lần. Khi bọ gậy sang tuổi 2 có thể ăn hỗn hợp ngày 3 lần, số lượng thức ăn, số lần ăn tăng khi bọ gậy sang tuổi 4 (không cho bọ gậy ăn nhiều vì thức ăn thừa sẽ làm hỏng nước nuôi). Dùng đầu tăm lấy thức ăn cho bọ gậy để không quá lượng quy định.
+ Trong trường hợp nước nuôi bọ gậy bẩn, có thể thay nước cho bọ gậy hoặc dùng ống hút hút chất bẩn ra.
+ Hàng ngày thêm nước vào khay nuôi bọ gậy. Nước nuôi bọ gậy là nước sạch, tuyệt đối không nhiễm hóa chất và các vi sinh vật kí sinh. Nên dùng nước uống tinh khiết để nuôi bọ gậy, có thể dùng nước máy cho bọ gậy Aedes nhưng phải để 3-5 ngày cho chloramin trong nước bay hơi.
Thức ăn cho bọ gậy:
Gan gà, gan vịt luộc, sấy khô, xay mịn để đảm bảo thức ăn nổi trên mặt nước. Tôm tươi hấp chín, sấy khô xay mịn.
Bột đậu xanh, ruột bánh mì hấp chín, sấy khô, xay mịn. Men saccaroza.
Trộn hỗn hợp trên với tỷ lệ: 1:1:1:1.
Quăng
+ Dùng ống hút có miệng rộng để nhặt quăng từ khay nuôi bọ gậy cho vào chén. Đặt các chén này vào lồng nuôi muỗi.
+ Sau 1-2 ngày quăng lột xác thành muỗi, lấy các chén ra.
Muỗi trưởng thành
+ Dùng một miếng bọt biển tẩm dung dịch đường Glucoza 10% và Polyvitamin đặt vào trong lồng nuôi muỗi. Thay bọt biển 2 ngày một lần.
+ Đặt các đĩa petri có giấy thấm nước cho muỗi đẻ.
Thức ăn: Đường glucose bột ( pha glucose bột thành dung dịch glucose 10%), multivitamin. Tỷ lệ pha trộn: 10 ml multivitamin: 50 ml dung dịch glucose 10%. Chuột nhắt trắng.
2.5.6. Kỹ thuật nuôi bọ gậy, muỗi Anopheles (An. dirus, An. epiroticus)
Mục đích của kỹ thuật: nhầm nhân rộng chủng bọ gậy thu thập ngoài thực địa, có 2 chủng bọ gậy muỗi Anopheles được sử dụng trong nghiên cứu. Chủng thứ nhất là chủng bọ gậy được nuôi tại phòng thí nghiệm khoa Côn Trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn (chủng labo). Chủng thứ hai là thu thập ngoài tự nhiên. Bọ gậy sau khi thu thập tại các điểm nghiên cứu sẽ được đem về phòng thí nghiệm khoa Côn Trùng, Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn tiếp tục nuôi giữ để phát triển lên muỗi (F0), sau đó cho muỗi (F0) đốt máu chuột hoặc thỏ để đẻ trứng, phát triển thành bọ gậy (F1), loăng quăng, muỗi (F1). Nếu số lượng cá thể bọ gậy thu thập ngoài thực địa không đủ để tiến hành thử nghiệm thì có thể sử dụng chủng bọ gậy thế hệ (F1) nuôi trong phòng thí nghiệm làm chủng thực địa sử dụng cho thử nghiệm.
Vật liệu
+ Lồng nuôi muỗi có kích thước 40x40x40 cm.
+ Đĩa cho muỗi đẻ: Dùng đĩa Petri có phủ một lớp bông thấm nước, bên trên đặt một tờ giấy thấm Whatman.
+ Khay men cao 12cm, đường kính 50cm hoặc khay nhựa nuôi bọ gậy có kích thước 25 x 30 x 6 cm.
+ Ống hút để thu thập bọ gậy, quăng. + Chén đựng quăng.
+ Ly giấy có vải màn phủ kín. + Ống hút muỗi
+ Ống nghiệm bằng thuỷ tinh đựng ether gây mê muỗi. + Kính lúp.
+ Ether.
+ Bông thấm nước.
+ Thức ăn cho bọ gậy: bột tôm, bột đậu xanh, bột bánh mì.
Quy trình nuôi bọ gậy Anopheles Trứng
Thu thập trong bát bằng nhựa sâu 12 cm và đường kính 20 cm, mực nước chứa trong bát khoảng 6-8 cm, xung quanh lót bằng giấy thấm Whatman cho muỗi đẻ.
Bọ gậy
Nuôi bọ gậy trong khay men, mỗi khay thả từ 300 - 500 bọ gậy. Trong thời gian đầu khi bọ gậy đang ở tuổi 1 mực nước trong khay khoảng 3-5 cm, khi bọ gậy sang tuổi 2,3,4 tăng dần lượng nước trong khay.
Thức ăn : Bọ gậy tuổi I ăn nước bột tôm hoà tan, mỗi ngày cho bọ gậy ăn 2 lần. Khi bọ gậy sang tuổi 2 có thể ăn hỗn hợp ngày 4 lần, số lượng thức ăn, số lần ăn tăng khi bọ gậy sang tuổi 4 (không cho bọ gậy ăn nhiều vì thức ăn thừa
sẽ làm hỏng nước nuôi). Dùng đầu tăm lấy thức ăn cho bọ gậy để không quá lượng quy định.
Trong trường hợp nước nuôi bọ gậy bẩn, có thể thay nước cho bọ gậy hoặc dùng ống hút hút chất bẩn ra.
Hằng ngày thêm nước vào khay nuôi bọ gậy. Nước nuôi bọ gậy là nước sạch, tuyệt đối không nhiễm hoá chất và các vi sinh vật kí sinh. Nên dùng nước uống tinh khiết để nuôi bọ gậy, có thể dùng nước máy nhưng phải để 3-5 ngày cho chloramin trong nước bay hơi.
Thức ăn cho bọ gậy:
+ Tôm tươi hấp chín, sấy khô, xay mịn.
Quăng
+ Dùng ống hút có miệng rộng để nhặt quăng từ khay nuôi bọ gậy cho vào chén. Đặt các chén này vào lồng muỗi.
+ Sau 2 -3 ngày quăng lột xác thành muỗi, lấy các chén ra.
Muỗi
+ Dùng một miếng bọt biển tẩm dung dịch đường Glucoza 10% và polyvitamin đặt vào trong lồng nuôi muỗi. Thay bọt biển 2 ngày 1lần.
+ Đặt bát nhựa xung quang có lót giấy thấm Whatman cho muỗi đẻ. - Kỹ thuật nuôi muỗi Anopheles
Vật liệu
+ Lồng nuôi muỗi có kích thước: 30x30x30 cm; 40x40x40 cm.
+ Đĩa cho muỗi đẻ: Dùng đĩa Petri có phủ một lớp bông thấm nước, bên trên đặt một tờ giấy thấm Whatman.
+ Khay nuôi bọ gậy bằng nhựa có kích thước: 20x30x6 cm. + Ống hút để thu thập bọ gậy, quăng.
+ Chén đựng quăng.
+ Ống hút muỗi.
+ Ống nghiệm bằng thủy tinh đựng ether gây mê muỗi. + Kim cắm muỗi làm giao cấu.
+ Kính lúp. + Ether.
+ Bông thấm nước.
+ Thức ăn cho bọ gậy: Gan gà, vịt, men Saccaroza, bột tôm, bột đậu xanh, bột bánh mì.
+ Thức ăn cho muỗi: Đường Glucoza 10%, polyvitamin, chuột nhắt trắng, chuột Hamster.
Quy trình nuôi muỗi Anopheles Trứng
+ Đặt 1-2 đĩa Petri có bông thấm nước và giấy thấm cho muỗi đẻ vào lồng nuôi muỗi có muỗi cái sắp đẻ. Chú ý giữ cho giấy thấm luôn luôn ẩm.