* Phương pháp lấy mẫu
Để khảo sát sự lưu hành virus cúm A trên gia cầm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu swab từ vịt tại các chợ bán gia cầm sống trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi, gồm: chợ Hàng Rượu (huyện Sơn Tịnh), chợ Sông Vệ (huyện Tư Nghĩa), chợ Chùa (huyện Nghĩa Hành).
Cách lấy mẫu: Đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu dịch nhầy sau đó từ từ rút ra đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. Que ngoáy được bảo quản trong dung dịch đệm PBS 0,01M pH = 7,2.
Mẫu sau khi được lấy tại các chợ được bảo quản và gửi về Trạm chẩn đoán, xét nghiệm thuộc Cơ quan Thú y Vùng IV để tiến hành xét nghiệm xác định sự lưu hành của virus cúm A/H5N1 và A/H5N6.
* Phương pháp xử lí mẫu
Mẫu swab gộp gửi đến được bảo quản trong dung dịch chứa trong các ống chuyên đựng mẫu swab. Trộn xốc ống mẫu vẫn còn tăm bông bên trong 15 giây sau đó ly tâm ống ở 1000g trong 10 phút và thu dung dịch nổi vào các ống Eppendorf. Tùy vào lượng dung dịch mà chia thành 1 hoặc 2 ống Eppendorf.
Sau khi xử lí mẫu, các ống Eppendorf được tiến hành tách RNA ngay sau đó. Nếu mẫu không được tách RNA ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800
C và trước khi tách mẫu được mang ra rã đông.
* Dụng cụ, máy móc, hóa chất
- Tủ lạnh âm -200C, -800C - Tủ lạnh thường 2-80C
- Buồng an toàn sinh học cấp độ II - Buồng an toàn sinh học cấp I (PCR)
- Hệ thống chiết xuất RNA bằng chân không hoặc ly tâm, Maxmag ambion, - Máy ly tâm lạnh ống Eppendorf tốc độ cao > 14000 rpm
- Máy ly tâm ống 15ml-50ml - Máy ly tâm nhỏ (Spin down) - Bể hấp cách thủy (Water bath) - Máy trộn ống nghiệm (vortex mixe)
- Hệ thống máy Real time PCR (BioRad – IQ5)
- Các loại ống đựng nguyên liệu 15ml, 50ml, Eppendorf 1,5ml và giá đỡ. - Ống chạy PCR 0,2 ml, đĩa chạy PCR 96 giếng, tríp chạy PCR
- Micropipet đơn kênh giới hạn 0,5-10, 1-20, 20-200, 100-1000 μl
- Đầu típ có lọc các loại 0,5-10, 1-20, 20-200, 100-1000 μl không có men phá hủy RNA/DNA
- Găng tay không bột hoặc găng nitrile, áo bảo hộ, khẩu trang,…
Hóa chất - Na 2HPO 4 - Na 2HPO 4.H 2O - NaCl - HCl - NaOH
- Nước dùng cho sinh học phân tử không có men RNase - Ethanol tuyệt đối
- Isopropanol 99% - Chloroform 99% - Trizol
Nguyên liệu
- Kít chiết tách RNA (Qiagen® RNeasy Extraction Kít) - Nguyên liệu nhân gen: + One-Step RT-PCR Qiagen®
+ Invitrogen Superscript 3 qRT-PCR kít - RNase Inhibitor, 40ui/µl
- MgCl2 (Promega) 25nM - Primer và prober
Bảng 2.1. Danh sách primer và prober
PPP Name (Source) Primer Probe code Primer/ Probe Sequence (5'-3') Modification 5' 3' Influenza A virus (Matrix) M-4 (CDC)
4P Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1 4F Forward CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC None None 4R Reverse AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA None None
Influenza A virus subtype H5 (HA2) H5-3S (AAHL+ Probe HA 2-3)
3P Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC
CTA GCA HEX BHQ1
1P(2.3) Probe TCAACAGTTGCGAGTTCTCTAGCA TET BHQ1 3F Forward ACG TAT GAC TAC CCG CAG
TAT TCA None None
3R Reverse AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC None None Influenza A virus subtype N1 (NA) N1-2 (China)
44P Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1 44F Forward TGGACTAGTGGGAGCAGCAT None None 44R Reverse TGTCAATGGTTAAGGGCAACTC None None Influenza A virus subtype N6 (NA) N6
44P Forward CCCCACCAATGGGAACTG FAM BHQ1 44F Probe
FAM-
AATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC- BHQ1
None None 44R Reverse TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC None None
* Nguyên lí phản ứng Real time PCR (RT–PCR)
- Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT–PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Realtime, máy có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Virus cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → cDNA gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT–PCR.
- Nguyên lí hoạt động của probe
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real time RT – PCR là Taqman Probe.
Hình 2.1. Cơ chế hoạt động của Taqman probe
Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.
* Các bước tiến hành phản ứng Real time RT – PCR cho virus cúm gia cầm
Các bước tiến hành phản ứng được thực hiện theo quy trình chung “Hướng dẫn của Cục thú y” trong phòng thí nghiệm. Bao gồm các bước:
1) Chiết tách RNA 2) Chuẩn bị Master mix 3) Template mẫu
4) Chạy PCR trên máy Bio – Rad hoặc Smart Cycle 5) Đọc kết quả
* Quy trình chiết tách RNA Chuẩn bị RLT
Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch đệm RLT bổ sung 2-mecraptoethanol tỷ lệ 1:100
RW1; RPE theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Tiến hành chiết xuất
Cho 600µl đệm RLT đã được bổ sung 2-mecraptoethanol vào ống Ependorf 1,5ml.
1) Chuyển 200µl mẫu vào ống Ependorf. Trộn xốc trong 15 giây sau đó quay ly tâm ở 5000vòng/phút trong 5 giây cho lắng xuống. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
2) Cho thêm 400µl ethanol 96 – 100% ở nhiệt độ phòng. Trộn xốc 10 giây rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút.
3) Lắp khóa van vào hệ thống và gắn cột lọc vào van. Bật máy hút chân không, điều chỉnh khóa van để P = 600.
4) Cho hết toàn bộ mẫu trên vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. 5) Cho 700µl RW1 vào cột lọc, rút hết dung dịch rửa trong cột lọc. 6) Cho 500µl RPE vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. 7) Lặp lại bước 7.
8) Lấy cột lọc ra cho vào ống lọc, li tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút
9) Lấy cột lọc đặt vào ống thu bổ sung theo kit, cho vào cột lọc 50µl đệm DW (Rnase-free.H2O). Sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 10.000 vòng/phút trong 3 phút.
10) Bỏ cột lọc, thu lấy RNA sang ống 0,5 ml không có men phá hủy RNA/DNA. 11) Cất giữ RNA, bảo quản ở 40C nếu sử dụng ngay, nếu không sử dụng trong ngày thì bảo quản ở -200
600µl đệm PBS
200µl mẫu. Trộn xốc 15s,
quay ly tâm 5000vòng/phút trong 5 phút
400 µl ethanol 96÷100%,
ly tâm 5000vòng/phút trong 5 phút
Gắn cột lọc và điều chỉnh hệ thống máy hút chân không
Cho toàn bộ mẫu vào cột lọc 700µl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc 500µl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc (lặp lại 2 lần)
Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm 1400vòng/phút trong 3 phút
Lấy cột lọc cho vào ống Eppendorf
Ly tâm 10.000vòng/phút trong 3 phút. Thu lấy
* Master mix
Hiện nay Cơ quan thú y vùng IV đang sử dụng bộ kít trong phản ứng Realtime RT – PCR là Quiagen one step RT-PCR.
Master mix là bước nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất đệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương đồng giữa primer và bộ gen đã chiết tách. Quá trình Master mix được tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau:
Chuẩn bị ống Eppendorf, trộn xốc rồi quay ly tâm các ống nguyên liệu, lần lượt cho các chất vào ống Eppendorf như sau:
Bảng 2.2. Thành phần Master mix
TT Nguyên liệu Nồng độ Lượng (µl)
1 DW 10,28 2 5x Buffer 5X 5 3 MgCl2 25mM 1,25 4 d NTP 10mM 0,8 5 P.P.P 20P mol FR 6 P mol P 1,5
6 RNase nhibior 40 Unit/µl 0,17
7 Enzyme mix 1
RNA của mẫu 5
Tổng 25
Sau khi cho các chất trên vào ống Eppendorf, tiến hành trộn xốc và quay ly tâm trong thời gian 10 – 15 giây, sau đó chia 20 µl vào các ống PCR 0,2ml.
* Template mẫu
Template là quá trình cho mẫu cần kiểm tra vào các tube có chứa nguyên liệu nhân gen trước đó trước khi chạy trên máy RT–PCR. Trước khi template mẫu, cần chuẩn bị số tube 0,2ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành theo các bước sau:
- Cho 5µl đối chứng âm vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng âm (Negative).
- Cho 5µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp Master mix của các tube mẫu.
- Cho 5µl mẫu đối chứng (+) vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng dương (Postive).
* Thực hiện phản ứng trên máy RT – PCR
Sau khi cho mẫu RNA vào ống PCR đã có nguyên liệu cho nhân gen thì tiến hành bố trí trên máy theo sơ đồ bố trí mẫu và chạy PCR theo chu trình luân nhiệt cho rRT – PCR trên máy Biorad IQ5 hoặc Smartcycler.
Invitrogen Superscript 3 qRT-PCR
Qiagen One-step RT-PCR Kít
Nhiệt độ Thời gian Nhiệt độ Thời gian Lặp lại
RT 500C 15 phút 500C 30 phút 0 950C 2 phút 950C 15 phút PCR 950C 10 giây 950C 10 giây 40 lần 600C 50 giây 600C 50 giây * Đọc kết quả
Sau khi kết thúc quá trình nhân gen kết quả được phân tích theo phần mềm của máy nhân gen.
Kết quả có giá trị khi:
Mẫu đối chứng dương cho giá trị Ct ngưỡng dao động + 2 so với giá trị Ct đã định ban đầu và có đường cong chuẩn.
Đối chứng âm không có tín hiệu khuếch đại đặc hiệu và giá trị Ct.
Đối chứng không có mẫu RNA, không có tín hiệu khuếch đại đặc hiệu và giá trị Ct. Nếu các điều kiện trên thỏa mãn thì tiến hành phân tích kết quả.
Phân tích kết quả:
Xác định đường cong chuẩn (S) có mặt trong mẫu được khuếch đại. Xác định giá trị Ct cho mẫu xét nghiệm.
Kết quả được xác định dương tính khi có sự khuếch đại đặc hiệu, đường cong khuếch đại tương tự như đường cong đối chứng dương và giá trị Ct nhỏ hơn 35.
Kết quả được xem là âm tính, khi không có sự khuếch đại đặc hiệu và không cho giá trị Ct.
Mẫu được xác định là nghi ngờ khi có đường cong khuếch đại giống đối chứng dương nhưng giá trị ngưỡng nằm trong khoảng 35 đến 40. Những mẫu nghi ngờ cần tiếp tục xét nghiệm lại và tiến hành phân lập virus.