L ỜI CẢM ƠN
2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng
gen ở một số giống lúa
Để xác định được một số yếu tốảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận gen ở giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87, thí nghiệm sử dụng gen chỉ thị GUS cho các thí nghiệm ở nội dung nghiên cứu này.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS của một số giống lúa
Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường thích hợp đã được xác định ở Nội dung 1. Để xác định tuổi mô sẹo phù hợp cho chuyển gen, thí nghiệm tiến hành lây nhiễm ở các giai đoạn mô sẹo khác nhau từ 3 đến 10 ngày tuổi. Các công thức bao gồm:
Công thức Tuổi mô sẹo
CT1 3 ngày tuối CT2 5 ngày tuổi CT3 7 ngày tuổi CT4 10 ngày tuổi
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp, tỷ lệ mẫu GUS dương tính (GUS+).
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen GUS ở một số giống lúa
Để lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở lúa, thí nghiệm tiến hành biến nạp với 4 chủng vi khuẩn khác nhau bao gồm:
Công thức Chủng vi khuẩn
CT1 AGL1
CT2 EHA105
CT3 GV3101
CT4 LBA4404
Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại, mỗi lần biến nạp 100 mô sẹo. Sau 14 ngày tiến hành đánh giá tỷ lệ mẫu sống sót và tỷ lệ mẫu mang gen GUS.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa
Mô sẹo có độ tuổi phù hợp được lựa chọn ở thí nghiệm 6 sử dụng làm vật liệu biến nạp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen môi trường biến nạp sẽ được bổ sung chất acetosyringnone (AS) ở các nồng độ khác nhau:
Công thức Nồng độ AS
CT1 0 µM
CT2 50 µM
CT3 100 µM
Sau biến nạp mô sẹo được đồng nuôi cấy trên môi trường đã chuẩn bị, mỗi đĩa 10 mô sẹo, nhiệt độđồng nuôi cấy là 250C.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp gen GUS
Sau khi lựa chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, thí nghiệm tiến hành xác định thời gian lây nhiễm mô sẹo với vi khuẩn. Các công thức thí nghiệm gồm:
Công thức Thời gian lây nhiễm
CT1 1 phút
CT2 2 phút
CT3 3 phút
CT4 4 phút
CT5 5 phút
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa
Thời gian đồng nuôi cấy mẫu được thử nghiệm với 5 công thức gồm:
Công thức Thời gian đồng nuôi cấy
CT1 1 ngày
CT2 2 ngày
CT3 3 ngày
CT4 4 ngày
CT5 5 ngày
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+. - Đánh giá sự biểu hiện gen GUS:
Sau khi lây nhiễm 3 ngày, mẫu cấy được nhuộm với dung dịch X-gluc (Phụ lục 4) và được ủ 48h ở 370C. Sau đó rửa mẫu với ethanol 96% để loại diệp lục tố và ghi nhận sự biểu hiện củagen gus. Khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa
thí nghiệm được đánh giá thông qua sự biểu hiện tạm thời của gen gus theo phương pháp của Hiei Y và cs, 2008) [27].
Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen
Thời gian nuôi cấy được thử nghiệm với 5 công thức:
Công thức Nồng độHygromycin CT1 5 mh/l CT2 10 mh/l CT3 15 mh/l CT4 20 mh/l CT5 25 mh/l Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống, mô sẹo chết.