L ỜI CẢM ƠN
1.9.Tình hình nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cây lúa trên thế giớ
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính của Việt Nam. Hiện nay, trên thế giới việc xác định chức năng gen ở cây lúa rất được chú trọng và giữ một vai trò quan trọng trong nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng. Bằng phương pháp nghiên cứu chức năng gen có thể khám phá ra được các gen kiểm soát những đặc điểm nông sinh học quan trọng như năng suất, chất lượng hạt, tính chống chịu strees sinh học và phi sinh học, hiệu quả sử dụng dinh dưỡng. Thành công trong kỹ thuật chuyển gen lua mở đường cho các nghiên cứu theo hướng chức năng gen.
Trước đây, phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm [18, 30]. Nhưng trong những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu báo cáo việc biến nạp gen thành công vào lúa nhờ vi khuẩn A. tumefaciens. Chan cs. (1992) là những người đầu tiên chuyển gen vào callus lúa mặc dù khi đó không thu được cây chuyển gen. Đến năm 1993, nhóm nghiên cứu này đã thu được cây lúa japonica chuyển gen đầu tiên nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens bằng cách nuôi cấy phôi non [9]. Hiện nay, phương pháp biến nạp gen vào lúa nhờ vi khuẩn A. tumefaciens là phương pháp được lựa chọn sử dụng hơn cả, do số bản sao của gen biến nạp được chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ thấp, bền vững [20]. Đặc biệt, phương pháp này cho hiệu quả chuyển gen cao, khả năng chuyển được đoạn ADN có kích thước lớn và chi phí thấp. Một trong những công trình nghiên cứu đánh dấu bước tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật chuyển gen lúa sử dụng A. tumefaciens là công trình của Hiei cs. (1994) [19]. Nhóm nghiên cứu này đã xây dựng được quy trình chuyển gen hiệu quả cho một số giống lúa nhóm japonica như Tsukinohikari, Asanohikari và Koshihikari. Từ đó, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi và cải tiến ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Giống lúa Taichung 65 được xem là giống mô hình đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu về di truyền ở cây lúa. Cho đến nay đã có nhiều thể đột biến phục vụ nghiên cứu được phát triển trên nền di truyền của Taichung 65 như: các thể đột biến phôi nhỏ re (Hong cs., 1995) [21], các thể đột biến phôi lớn ge (Hong cs., 1995), các thểđột biến không có chồi shl (Satoh cs., 1999) [28]; các thể đột biến không có rễ bên lrt, một số thể đột biến không có rễ bất định crl (Inukai cs., 2005) [23], thể đột biến không có rễ mầm
ral (Enrico cs., 2003) [15],... Do các thểđột biến này đều có chung nền di truyền với giống lúa Taichung 65, nên việc xây dựng một quy trình chuyển gen hiệu quả áp dụng cho Taichung 65 là đặc biệt quan trọng cho các nghiên cứu gen dựa trên những thểđột biến này, góp phần thúc đẩy quá trình nghiên cứu cơbản và ứng dụng ở lúa. Trong nghiên cứu biến nạp gen vào Taichung 65 từ callus phôi hóa, nhóm nghiên cứu của Yara cs. (2001) [36] đã sử dụng nền môi trường cơ bản N6 cho nuôi cấy và đạt được tỷ lệ chuyển gen là 4,6%. Mới đây, Chopita cs. (2014) [11] đã công bố nghiên cứu về chức năng của gen OSB2 liên quan đến sự điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin ở cây lúa bằng cách gây siêu biểu hiện gen OSB2 trong giống Taichung 65. Nhóm nghiên cứu cũng đã áp dụng phương pháp biến nạp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens từ callus phôi hóa và chọn lọc callus chuyển gen lần lượt trên hai môi trường dinh dưỡng có bổ sung hygromycin với lượng tăng từ 15 - 30 mg/l, cho tỷ lệ mẫu callus biểu hiện gen GUS 7,59%.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu là hạt chín của 4 giống lúa thuần được trồng phổ biến ở các tỉnh miền núi phía Bắc.
Bảng 2.1. Danh mục giống nghiên cứu STT Tên giống Loài phụ Nguồn gốc
1 Đoàn kết Indica Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật 2 Bao thai Indica Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật 3 Nếp 87 Indica Trung tâm Tài nguyên di truyền Thực vật 4 Khang dân Indica Công ty giống cây trồng Thái Bình
2.1.2. Vật liệu sử dụng và phạm vi nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất thiết bị sử dụng:
- NaClO, cồn, tween.
- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962), N6; các chất kích thích sinh trưởng: BAP (Duchefa), NAA (Trung quốc), Acetoseringone (Sigma), L-pyroglutamic (Duchefa), L-asparagine (Duchefa),...
- Kháng sinh: Rifamycin, spectomycin, cefotaxim, vancomycin, ticarcillin,... - Hóa chất khác: Yeast tract, pepton, NaCl, agarose, sucrose,...
Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức), tủ nuôi lắc LSI (Hàn Quốc), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo (Nhật bản), micropipette,...
Nos ployA LacZ 35S gus 35S bar LB RB 2.1.2.2. Vật liệu di truyền
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: AGL1, EHA105, GV3101, LBA4404. Vector chuyển gen pCAMBIA3301 mang gen chỉ thị GUS được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Hình 2.1. T-DNA của plasmid pCambia3301 mang gen bar và gen gus, mỗi gen
điều kiển bởi CaMV 35S promoter (LB: ranh giới trái, RB: ranh giới phải)
Vector pCambia 3301 (hình 3.1) mang gen chọn lọc thực vật là gen bar, gen chọn lọc vi khuẩn là gen kháng kanamycin(r), gen chỉ thị là gen gusA và gen này được chia thành 2 exon là gus first exon và gusA second exon phân cách nhau bởi đoạn Intron Catalase, đoạn kết thúc chuỗi là NOS polyA, vị trí đa điểm là pUC18-
lacZa, dưới sự điều khiển của promoter CaMV35S (Cauliflower Mosaic Virus) và được quy định bởi trình tự CaMV35S polyA.
2.1.2.3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tái sinh in vitro và xây dựng quy trình chuyển gen ở một số giống lúa.
2.1.3. Thiết bị sử dụng
- Tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, cân phân tích, tủ sấy, máy đo pH và… một số trang thiết bị khác tại Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm –Đại học Thái Nguyên.
2.2. Địa điểm và thời gian tiến hành
- Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên
- Thời gian tiến hành: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 1/2019 đến tháng 5/2019.
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nội dung 1: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của một số giống lúa
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng NaOCl đến hiệu quả vô trùng mẫu nuôi cấy.
Thí nghiệm được bố trí 4 công thức khác nhau:
Công thức Nồng độ NaOCl Thời gian khử trùng
CT1 3% 10
CT2 3% 15
CT3 3% 20
CT4 3% 25
Cách tiến hành: Hạt lúa được tách vỏ, sau đó hạt lúa được rửa bằng cồn 70˚C trong 1 phút để sơ loại các mầm bệnh và tăng hiệu quả khử trùng. Sau đó đổ cồn và ngâm hạt vào dung dịch sodium hypochlorite 3% với thời gian khử trùng khác nhau.
Cuối cùng, rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Sau khi khử trùng mẫu được gắp mẫu đặt lên giấy thấm đã được vô trùng, đợi khô. Cấy mẫu vào môi trường mô sẹo tạo mô sẹo có chứa 2,4-D. Sau đó đưa vào phòng nuôi, tiến hành theo dõi mẫu.
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần và mỗi công thức 100 mẫu.
Các chỉ tiêu theo dõi như sau: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu chết.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng
tạo mô sẹo của một số giống lúa
Hạt sau khi khử trùng bằng NaClo được nuôi cấy tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D trên nền môi trường MS và N6 + 30g đường/l + 7g agar/l, pH 5,6. Các thí nghiệm được bố trí theo công thức sau:
Công thức Môi trường nền
CT1 MS
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 100 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo tạo thành, màu sắc mô sẹo và chất lượng mô sẹo
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo ở một số giống lúa
Để xác định nồng độ 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo ở lúa, tiến hành thử nghiệm một số nồng độ 2,4-D dựa trên nền môi trường xác định ở Thí nghiệm 2. Các công thức thí nghiệm bao gồm:
Công thức Nồng độ 2,4-D
CT1 0 mg/l
CT2 1,0 mg/l CT3 2,0 mg/l CT4 3,0 mg/l
Thí nghiệm được bố trí với 4 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại.
Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ lệ mẫu chết, hình thái mô sẹo sau 14 ngày nuôi cấy.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi
Sau 28 ngày nuôi cấy mô sẹo có hình thái đồng đều trên môi trường 2,4-D được chuyển sang môi trường tái sinh chồi bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau theo các công thức thí nghiệm như sau:
Công thức Nồng độ BAP CT1 0 mg/l CT2 0,5 mg/l CT3 1,0 mg/l CT4 1,5 mg/l CT5 2,0 mg/l
Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại. Các chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi sau 28 ngày nuôi cấy. Môi trường nền sử dụng MS/N6 + 30g/l đường + 7g/l agar, pH 5,6.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi
Tương tự như BAP, kinetin được sử dụng để đánh giá khả năng tái sinh in vitro ở các nồng độ khác nhau. Các công thức thí nghiệm bao gồm:
Công thức Nồng độ kinetin CT1 0 mg/l CT2 0,5 mg/l CT3 1,0 mg/l CT4 1,5 mg/l CT5 2,0 mg/l
Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức (CT), mỗi công thức sử dụng 100 mẫu, 3 lần nhắc lại. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu bật chồi, chất lượng chồi sau 28 ngày nuôi cấy. Môi trường nền sử dụng MS/N6 + 30g/l đường + 7g/l agar, pH 5,6.
2.3.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tốđến khả năng chuyển gen ở một số giống lúa gen ở một số giống lúa
Để xác định được một số yếu tốảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận gen ở giống lúa Khang dân, Bao thai, Đoàn kết và Nếp 87, thí nghiệm sử dụng gen chỉ thị GUS cho các thí nghiệm ở nội dung nghiên cứu này.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô sẹo đến khả năng tiếp nhận gen GUS của một số giống lúa
Mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường thích hợp đã được xác định ở Nội dung 1. Để xác định tuổi mô sẹo phù hợp cho chuyển gen, thí nghiệm tiến hành lây nhiễm ở các giai đoạn mô sẹo khác nhau từ 3 đến 10 ngày tuổi. Các công thức bao gồm:
Công thức Tuổi mô sẹo
CT1 3 ngày tuối CT2 5 ngày tuổi CT3 7 ngày tuổi CT4 10 ngày tuổi
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp, tỷ lệ mẫu GUS dương tính (GUS+).
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp gen GUS ở một số giống lúa
Để lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở lúa, thí nghiệm tiến hành biến nạp với 4 chủng vi khuẩn khác nhau bao gồm:
Công thức Chủng vi khuẩn
CT1 AGL1
CT2 EHA105
CT3 GV3101
CT4 LBA4404
Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại, mỗi lần biến nạp 100 mô sẹo. Sau 14 ngày tiến hành đánh giá tỷ lệ mẫu sống sót và tỷ lệ mẫu mang gen GUS.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringone (AS) đến hiệu quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa
Mô sẹo có độ tuổi phù hợp được lựa chọn ở thí nghiệm 6 sử dụng làm vật liệu biến nạp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen môi trường biến nạp sẽ được bổ sung chất acetosyringnone (AS) ở các nồng độ khác nhau:
Công thức Nồng độ AS
CT1 0 µM
CT2 50 µM
CT3 100 µM
Sau biến nạp mô sẹo được đồng nuôi cấy trên môi trường đã chuẩn bị, mỗi đĩa 10 mô sẹo, nhiệt độđồng nuôi cấy là 250C.
Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.
Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả biến nạp gen GUS
Sau khi lựa chọn được chủng vi khuẩn thích hợp, thí nghiệm tiến hành xác định thời gian lây nhiễm mô sẹo với vi khuẩn. Các công thức thí nghiệm gồm:
Công thức Thời gian lây nhiễm
CT1 1 phút
CT2 2 phút
CT3 3 phút
CT4 4 phút
CT5 5 phút
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+.
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen GUS của một số giống lúa
Thời gian đồng nuôi cấy mẫu được thử nghiệm với 5 công thức gồm:
Công thức Thời gian đồng nuôi cấy
CT1 1 ngày
CT2 2 ngày
CT3 3 ngày
CT4 4 ngày
CT5 5 ngày
Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống sót, tỷ lệ mẫu GUS+. - Đánh giá sự biểu hiện gen GUS:
Sau khi lây nhiễm 3 ngày, mẫu cấy được nhuộm với dung dịch X-gluc (Phụ lục 4) và được ủ 48h ở 370C. Sau đó rửa mẫu với ethanol 96% để loại diệp lục tố và ghi nhận sự biểu hiện củagen gus. Khả năng tiếp nhận gen của một số giống lúa
thí nghiệm được đánh giá thông qua sự biểu hiện tạm thời của gen gus theo phương pháp của Hiei Y và cs, 2008) [27].
Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của nồng độ hygromycin đến đến hiệu quả chọn lọc chuyển gen
Thời gian nuôi cấy được thử nghiệm với 5 công thức:
Công thức Nồng độHygromycin CT1 5 mh/l CT2 10 mh/l CT3 15 mh/l CT4 20 mh/l CT5 25 mh/l Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ mô sẹo sống, mô sẹo chết.
2.4. Điều kiện bố trí thí nghiệm
Các bình nuôi cấy in vitrođược đặt trong phòng nuôi cấy với các điều kiện như: - Số giờ chiếu sáng: 10h - 12h/ ngày
- Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 25°C ± 2°C - Độẩm: 60- 70%
- Cường độ chiếu sáng: 2000 – 2500 lux
2.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá.
2.5.1. Các chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian theo dõi:
+ Đối với thí nghiệm vào mẫu: tiến hành theo dõi số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu sống.
+ Đối với thí nghiệm tạo mô sẹo: theo dõi số mẫu nhiễm, số mẫu chết, số mẫu tạo mô sẹo.
+ Đối với thí nghiệm tái sinh chồi theo dõi sau 2 tuần và 4 tuần.
2.5.2. Các chỉ tiêu đánh giá
- Chỉ tiêu theo dõi khử trùng mẫu:
Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu chết sau biến nạp x 100 Tổng số mẫu biến nạp
Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu sống sau biến nạp x 100 Tổng số mẫu biến nạp
- Chỉ tiêu theo dõi mô sẹo:
Tỷ lệ mô sẹo (%) = Số mẫu tạo mô sẹo x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy
- Chỉ tiêu theo dõi chồi:
Tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = Số mẫu tái sinh chồi x 100 Tổng số mẫu nuôi cấy Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu chết sau biến nạp x 100 Tổng số mẫu biến nạp - Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sau biến nạp: Tỷ lệ mẫu sống (%) = Số mẫu sống sau biến nạp x 100 Tổng số mẫu biến nạp
Khả năng tiếp nhận gen được đánh giá dựa trên tổng số mẫu có biểu hiện màu xanh chàm trong tổng số mẫu kiểm tra và được tính toán theo công thức sau:
Tỷ lệ mẫu biều hiện gen GUS (%) =
Số mẫu GUS+
x 100 Tổng số mẫu nhuộm