3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.5.2. Nghiên cứu sự biến đổi bệnh lý ruột non của lợn con bị tiêu chảy do E.coli
Để nghiên cứu biến đổi bệnh lý ở ruột non của lợn bị tiêu chảy do E. coli chúng tôi bố trí lấy mẫu thí nghiệm theo bảng 2.1
Bảng 2.1: Bảng bố trí lợn mổ khám, lấy mẫu
Lợn không bị tiêu chảy Lợn bị tiêu chảy
Tuổi (ngày) 3 7 21 3 7 21
Số lượng (con) 3 3 3 3 3 3
Trong số lợn con bị tiêu chảy theo dõi được chẩn đoán là do vi khuẩn E. coli
thông qua việc khám lâm sàng (đánh giá các triệu chứng), cận lâm sàng (kiểm tra độ pH của phân) và giám định vi khuẩn học (lấy mẫu phân và nuôi cấy trên môi trường
đặc hiệu EMB). Để đảm bảo sự đồng nhất của mẫu, lợn bị bệnh được theo dõi sẽ được mổ khám ở ngày thứ 3 sau khi mắc bệnh.
2.5.2.1. Nghiên cứu biến đổi bệnh lý ruột non ở mức đại thể (macroscopic pathological study)
Chúng tôi tiến hành mổ khám ngẫu nhiên lợn con ở các giai đoạn 3 ngày tuổi, 7 ngày tuổi và 21 ngày tuổi bị tiêu chảy do E. coli (n=3/lứa tuổi) và không bị tiêu chảy (n=3/lứa tuổi). Lợn được được gây mê bằng thuốc mê Zoletin 50 (Virbac, 1 ml/10kgP) qua đường tiêm dưới da hoặc tĩnh mạch cổ. Ngay sau khi mê (khoảng 1 phút đối với tiêm tĩnh mạch và 5 phút đối với đường tiêm dưới da), lợn con được trợ tử bằng cách dùng dao mổ chọc vào vịnh tĩnh mạch cổ. Sau đó lợn được đặt lên bàn mổ, ống tiêu hóa của lợn bao gồm dạ dày, ruột non, ruột già, được lấy ra khỏi xoang bụng và được kiểm tra đại thể. Các đoạn ruột lần lượt được tách khỏi màng treo ruột, để ở trạng thái thẳng để đo độ dài trong khi không có bất cứ một lực kéo giãn ruột nào được tác động. Đường kính của các đoạn ruột cũng được đo bằng cách sử dụng thước kẹp (Mitutoyo 530-114). Ruột non được chia thành các phần bao gồm tá tràng, không tràng và hồi tràng theo mô tả của Huỳnh Thị Minh Tâm (2015). Ruột non được chia làm 3 phần, đoạn hồi tràng ngắn, bắt đầu từ lỗ môn vị của dạ dày đến vị trí quai ruột, không tràng và hồi tràng tạo thành các quai ruột hình chữ u, trong đó đoạn không tràng có đường kình lớn hơn đoạn hồi tràng.
Các quan sát về màu sắc của ruột, mức độ xuất huyết niêm mạc, độ tắc nghẽn thức ăn trong dạ dày, độ dài của các đoạn tá tràng, không tràng, hồi tràng, vị trí tắc nghẽn trong ruột non được thực hiện.
2.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu bệnh lý vi thể
Khoảng 20 cm ruột non tại các trung điểm của các đoạn tá tràng, không tràng và hồi tràng của lợn con được lấy ngay sau khi mổ lợn. Đoạn ruột được chọn được buộc chặt hai đầu bằng chỉ, và được bơm formalin 10% vào bên trong sao cho vừa đủ để giữ nguyên hình dáng của ruột non. Các đoạn ruột sau đó được cắt rời và được ngâm trong formalin 10% trong 6h. Sau đó mẫu ruột được cắt thành lát mỏng với độ dày 0.5 cm (cắt ngang, 3 lát/mẫu) và 1 cm (cắt dọc, 3 lát/mẫu) và được để vào hộp chứa mẫu (catssete), ghi nhãn và được ngâm trong formalin 10% qua đêm trong điều kiện nhiệt độ phòng và có khuấy đảo. Mẫu sau đó được rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 1h rồi chuyển sang chuỗi khử nước như sau:
Bảng 2.2: Quy trình chuỗi khử nước L1
Cồn Cồn 700 Cồn 900 Cồn 900 Cồn 1000 Cồn 1000
Thời gian Qua đêm 120 phút 120 phút 60 phút 60 phút
Mẫu sau đó được chuyển vào chuỗi khử cồn và vùi nến như sau:
Bảng 2.3: Quy trình chuỗi khử cồn và vùi nến
Dung dịch Xylen Lần 1 Xylen Lần 2 Xylen – paraffin nóng 600 Paraffin nóng 600 Đúc vào khuôn
Thời gian 90 phút 90 phút 60 phút 60 phút Khoảng 1h Đúc khuôn
Miếng bệnh phẩm được đặt vào chính giữa khuôn. Paraffin lỏng được rót vào khuôn sao cho không có có bọt khí xuất hiện. Mẫu đã đúc khuôn được để nguội từ từ cho đến khi đông chắc và được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi thực hiện các bước tiếp theo.
Quy trình cắt mẫu Cắt lát mô
Lát cắt có độ dày khoảng 4-8µm được cắt bằng máy cắt mô (microtome) Duỗi lát cắt mô
Sau khi được cắt, lát cắt được đặt lên bề mặt nước ấm 400C. Những lát cắt đạt yêu cầu (không bị gấp nếp, không bị rách) sẽ được vớt lên một phiến kính sạch đã được phủ một hỗn hợp gồm lòng trắng trứng gà và glycerin.
Quy trình khử paraffin
Lát cắt mô được khử paraffin theo quy trình sau:
Bảng 2.4: Quy trình khử paraffin
Xylen 1 Xylen 2 Xylen3
Cồn 1000 (lần 1) Cồn 1000 (lần 2) Cồn 900 Cồn 700 Nước 3phút 3phút 3phút 2 phút 2 phút 3 phút 3 phút 3 phút
Quy trình nhuộm mẫu:
- Mẫu được ngâm trong thuốc nhuộm hematoxylin (0,4%) trong 5 phút. - Ngâm trong nước ấm (40oC) trong 5 phút.
- Ngâm trong nước lạnh 10 phút.
- Ngâm trong thuốc nhuộm Eosin 1% trong 30 giây.
- Mẫu được rửa nước trong vài giây, rồi được chuyển vào chuỗi khử nước như sau:
Bảng 2.5: Quy trình chuỗi khử nước L2
Cồn 700 Cồn 900 Cồn 100
0
(lần 2)
Cồn 1000
(lần 1) Xylen 3 Xylen 2 Xylen 1
30 giây 1 phút 3 phút 3 phút 3 phút 3 phút 3 phút
- Cuối cùng, mẫu được phủ canadian balsam, đậy lamen và được bảo quản cho đến khi được soi dưới kính hiển vi.
Khi soi dưới kính hiển vi nếu thấy nhân tế bào bắt màu xanh tím, bào tương mạch máu và hồng cầu (nếu có) bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là đạt yêu cầu.