Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp mổ khám không toàn diện của Skrjabin K.I. (1963), với mục đích xác định tỷ lệ, cường độ nhiễm sán lá ruột và quan sát những biến đổi đại thể của cơ quan tiêu hoá do sán lá ruột gây ra. Căn cứ vào nội dung nghiên cứu, sau khi điều tra thu thập thông tin về nguồn gốc, lứa tuổi của gà và vịt tại các địa điểm điều tra, gà và vịt được chọn ngẫu nhiên để tiến hành mổ khám.
Trước khi mổ khám: làm chết gà, vịt sau đó mổ từ hậu môn đến xương ức để
bộc lộ các nội quan, tách riêng từng bộ phận, lấy cơ quan tiêu hoá để kiểm tra (Lấy từ ruột non đến hậu môn).
Ruột non, ruột già, manh tràng được tách riêng và kiểm tra từng phần. Dùng kéo mũi nhọn cắt dọc theo thành ruột, quan sát bằng mắt thường và kính lúp để phát hiện sán lá ruột và thu mẫu sán trong chất chứa (sau khi gạn rửa sa lắng chất chứa) và những sán còn bám trên niêm mạc cho vào đĩa petri. Sau khi định loại sơ bộ, mỗi loài sán lá ruột được bảo quản ở lọ riêng (sơ bộ định danh). Mẫu vật sán của mỗi gà và vịt cũng được để riêng.
Mẫu sán lá ruột thu thập đều được bảo quản trong cồn 70o. Cách làm như sau:
để sán chết tự nhiên trong nước, sau khi rửa sạch, ép mỏng giữa 2 phiến kính rồi đặt vào bình thuỷ tinh có chứa cồn 70o.
Sau thời gian ép mẫu, chuyển sang các lọ chứa cồn 70o và ghi nhãn với các thông tin: vị trí ký sinh, lớp, số lượng sán, số lượng gà mổ khám, tuổi gà, vịt địa
điểm và thời gian mổ khám... Những thông tin ghi trên nhãn cũng được ghi đầy đủ vào sổ mổ khám.
2.4.6. Phương pháp làm tiêu bản để xác định tên loài sán
Để xác định loài sán lá ruột chúng tôi sử dụng phương pháp làm tiêu bản sán lá theo phương pháp nhuộm Carmin (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996). Cụ thể như sau:
- Phương pháp làm tiêu bản tạm thời:
Đặt mẫu sán lên lam kính, nhỏ một giọt dung dịch hỗn hợp gồm glyxerin + axít lactic + nước cất theo tỷ lệ 1:1:1 hoặc có thể làm trong mẫu bằng glyxerin mà không cần axít lactic. Thời gian làm trong mẫu tuỳ thuộc vào kích thước và độ dày mỏng của mẫu.
- Làm tiêu bản sán lá theo phương pháp nhuộm Carmin và gắn Baume cannada: Pha dung dịch nhuộm Carmin: Lấy 5g Carmin nghiền nhỏ cho vào bình tam giác chứa 5ml HCl và 5ml nước cất, để yên sau 1 giờ, sau đó cho thêm 200ml cồn 90o, lắc đều, đậy nút bông, đun cách thuỷ cho đến khi Carmin tan hết, để 1 ngày rồi lọc. Dung dịch để sau 1 tuần đến 10 ngày mới dùng.
- Nhuộm: Cho mẫu vào dung dịch nhuộm từ 5 phút đến 1 giờ tuỳđộ lớn của mẫu, đến khi mẫu bắt màu đẹp là được. Trường hợp bắt màu quá đậm, có thể làm nhạt màu bằng cách cho mẫu sán vào dung dịch cồn - axít HCl 1% (100ml cồn 70o pha với 1ml HCl).
- Rút nước: Vớt mẫu sán ra, cho lần lượt vào dung dịch cồn ở các nồng độ: 70o, 90o, 95ođể rút nước, mỗi nồng độ ngâm trong 5 đến 7 phút.
- Làm trong mẫu bằng dung dịch xylen + cồn 96o theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 1 - 2 phút.
- Cốđịnh tiêu bản: Nhỏ lên lam kính 1 - 2 giọt baume canada, đặt mẫu vào, nhỏ tiếp 1 giọt baume canada lên trên rồi đậy lamen lại. Để khô tiêu bản.
2.4.7. Phương pháp định danh các loài sán lá ruột
Việc định danh phân loại các loài sán lá ruột ký sinh ở gà, vịt dựa vào những đặc
điểm hình thái, kích thước, cấu tạo theo hệ thống định loại sán lá (Nguyễn Thị Lê và cs., 1996).
Sau khi phân loại xong, thay nhãn cho các lọ mẫu. Nhãn ghi rõ số gà và vịt mổ khám, vị trí ký sinh, tên loài sán lá ruột, số lượng, địa điểm, ngày tháng mổ khám, người mổ khám.
Kết quảđịnh danh được ghi vào sổ mổ khám.
2.4.8. Phương pháp xác định bệnh lý lâm sàng và bệnh tích đại thể, những biến đổi vi thể ở cơ quan tiêu hoá (ruột non, manh tràng và ruột già) do sán lá ruột gây ra
- Bệnh lý lâm sàng được xác định bằng cách theo dõi tất cả những gà, vịt có kết quả kiểm xét nghiệm phân dương tính với sán lá ruột.
Xác định những biến đổi lâm sàng của gà, vịt bệnh bằng cách trực tiếp quan sát: mào, tích, thể trạng, phân, ăn uống, vận động... kết hợp với hỏi chủ hộ nuôi gà, vịt.
- Bệnh tích đại thể được xác định bằng cách quan sát kỹ những tổn thương ở
niêm mạc ruột non, manh tràng và ruột già của những gà, vịt bị nhiễm sán lá ruột. Quan sát bằng mắt thường qua kính lúp các phần ruột gà và vịt để tìm bệnh tích của bệnh.
- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc Parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin, đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học Labophot - 2 và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi.
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo thứ tự các bước sau:
+ Lấy bệnh phẩm: Cắt phần bệnh phẩm có nhiều sán lá ruột ký sinh (ruột non, ruột già và manh tràng).
+ Cố định bằng dung dịch formol 10% với tỷ lệ 1 phần bệnh phẩm với 9 phần formol 10%. Ruột gà cắt ngắn 3 - 5 cm và cốđịnh trong 36 giờ.
+ Sau khi cốđịnh, rửa tổ chức dưới vòi nước chảy nhẹ từ 12 - 24 giờđể loại bỏ
Formol có trong tổ chức.
+ Khử nước: Dùng cồn nồng độ từ thấp đến cao dần để khử nước, cuối cùng dùng cồn tuyệt đối để rút hết nước trong bệnh phẩm ra.
+ Làm trong tiêu bản: Ngâm bệnh phẩm qua hệ thống xylen để làm trong bệnh phẩm.
+ Tẩm parafin: Ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đã đựng Parafin nóng chảy, đểở tủấm nhiệt độ 56oC.
+ Đổ Block: Rót Parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm Parafin vào, khi Parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại Block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: Cắt bệnh phẩm trên máy cắt microtom, độ dày mảnh cắt 3 - 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng gà 1 phần, glyxerin 1 phần; 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin - Eosin. Phương pháp tiến hành như sau:
Trước tiên tẩy nến bằng Xylen, sau đó ngâm tiêu bản tổ chức vào cồn Ethanol 96% trong 5 phút. Tiêu bản tổ chức được rửa dưới dòng nước chảy nhẹ trong 5 phút và nhuộm Hematoxilin trong 5 phút, sau đó lại rửa nước trong 15 phút và nhuộm Eosin trong 1- 2 phút. Rửa nước (dưới dòng nước chảy nhẹ) và làm khô tiêu bản trong dung dịch cồn có nồng độ tăng dần 96% đến 100% với thời gian giảm dần từ 5 phút đến 2 phút.
2.4.9. Phương pháp theo dõi hiệu lực của thuốc tẩy sán lá ruột ở gà, vịt
2.4.9.1 Phương pháp bố trí và theo dõi thí nghiệm thử nghiệm thuốc tẩy sán lá ruột cho gà, vịt trên diện hẹp
Chúng tôi sử dụng 3 loại thuốc sau gồm: bio-fenbendazol, arecolin, piperazine
để tẩy sán dây cho gà. Thành phần của mỗi loại thuốc như sau:
- Thuốc bio-fenbendazol gồm: fenbendazole, CaCO3, rice Hulls vừa đủ
Liều dùng: 8mg/ kg TT
- Thuốc arecolin gồm: arecolin và tá dược Liều dùng: 2mg/ kg TT
- Thuốc piperazine gồm: piperazine và tá dược vừa đủ
Liều dùng: 2mg/ kg TT
- Sử dụng thuốc 3 loại thuốc trên tẩy cho số lượng nhỏ gà, vịt mắc bệnh sán lá ruột (mỗi loại thuốc dùng cho 10 gà, 10 vịt); sau khi sử dụng thuốc 10 - 15 ngày, xét nghiệm lại phân gà bằng phương gạn rửa sa lắng. Nếu không tìm thấy trứng sán lá ruột trong phân thì xác định thuốc có hiệu lực triệt để đối với sán lá ruột; nếu vẫn thấy trứng sán lá ruột trong phân nhưng số lượng giảm rõ rệt thì xác định thuốc có hiệu lực với sán lá ruột nhưng không triệt để; nếu số lượng trứng vẫn không giảm hoặc giảm không đáng kể so với trước khi dùng thuốc thì xác định thuốc không có hiệu lực với sán lá ruột gà, vịt.
- Mổ khám những gà, vịt dùng thuốc tẩy sán lá ruột để tìm sán lá ruột. Nếu không tìm thấy sán lá ruột nào thì xác định thuốc có hiệu lực triệt để đối với sán lá ruột; nếu vẫn tìm thấy sán lá ruột nhưng số lượng ít thì xác định thuốc có hiệu lực với sán lá ruột nhưng không triệt để; nếu gà, vịt vẫn nhiễm nhiều sán lá ruột thì xác
định thuốc không có hiệu lực với sán lá ruột gà, vịt.
2.4.9.2. Phương pháp đánh giá hiệu lực của thuốc tẩy sán lá ruột cho gà, vịt trên diện rộng
- Sau khi xác định được thuốc có hiệu lực tốt với sán lá ruột trên số lượng ít gà, vịt, tiếp tục dùng thuốc đó cho số lượng lớn gà, vịt ngoài thực địa. Kiểm tra lại phân sau 15 ngày dùng thuốc để xác định hiệu lực của thuốc.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học của Nguyễn Văn Thiện và cs, 2002, trên phần mềm Excel 2010.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH SÁN LÁ RUỘT Ở GÀ, VỊT NUÔI TẠI 3 HUYỆN THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN
3.1.1. Thành phần loài sán lá ruột ký sinh ở gà, vịt nuôi tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên Thái Nguyên
Bảng 3.1. Những loài sán lá ký sinh ở ruột gà, vịt và tần suất xuất hiện của chúng tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
Thành phần loài sán lá ruột ở gà
Vị trí ký sinh
Phân bố tại các địa phương
(huyện) Tần suất xuất hiện (%) Đồng Hỷ Phú Lương Phú Bình Hypoderaeum conoideum Bloch, 1782 Ruột non, manh tràng x x x 100 Echinostoma revolutum Frohlich, 1802 Ruột non, manh tràng x x - 67,70 Notocotylus intestinalis Tubangui, 1932 Ruột non, manh tràng x x x 100 Tổng loài phát hiện 3/3 3/3 2/3
Qua bảng 3.1 cho thấy, qua mổ khám và định loại sán đã phát hiện được 3 loài sán lá ký sinh ở ruột gà, vịt tại các địa điểm nghiên cứu trên. Sán lá ruột
Hypoderaeum conoideum và Notocotylus intestinalis xuất hiện ở tất cả các địa điểm nghiên cứu với tần xuất 100%, loài Echinostoma revolutum chỉ thấy xuất hiện ở 2 huyện Đồng Hỷ và Phú Lương với tần suất xuất hiện 67,70%. Như vậy, gà và vịt nuôi ở 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên nhiễm 3 loài sán lá ruột, đó là: Hypoderaeum conoideum, Echinostoma revolutum và Notocotylus intestinalis. Đây là 3 loài sán lá phổ biến và gây tác hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm của nhiều nước trên thế
giới, trong đó có Việt Nam.
Cả 3 loài sán lá Hypoderaeum conoideum, Echinostoma revolutum và Notocotylus intestinalis đều ký sinh chủ yếu ở ruột non và một số ít ký sinh ở manh tràng của gà. Theo Hoàng Toàn Thắng và Cao Văn (2006), ruột non là cơ quan hấp
thu chính của ống tiêu hóa, đặc điểm cấu tạo của ruột non thuận lợi cho sự hấp thu các chất dinh dưỡng. Tại đây, tất cả các chất dinh dưỡng đều được hấp thu ở ruột non như đường đơn, amino axit được hấp thu vào máu, các axit béo được hấp thu vào mạch bạch huyết.... Nhờ ký sinh tại ruột non mà sán lá ruột có điều kiện sinh trưởng, phát triển tốt.
Nguyễn Nhân Lừng và cs. (2011) đã mổ khám 1.440 gà thả vườn tại 6 huyện thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang thấy có 7 loài sán lá ký sinh ở gà gồm:
Echinostoma revolutum, E. miyagawaj, Echinoparyphium recurvatum, Hypoderaeum conoideum, Notocotylus intestinalis, Prostiiogonimus cuneatus, Prostiiogonimus ovatus.Lê Đắc Lợi (2015) cũng tìm thấy 4 loài sán lá ruột ký sinh
ở gà nuôi tại một số huyện thuộc tỉnh Thanh Hóa, các loài đó là: Echinostoma revolutum, Echinostoma miyagawai, Echinoparyphium recurvatum và Notocotylus intestinalis.
Như vậy, thành phần loài sán lá ruột ký sinh ở gà, vịt của 3 huyện Đồng Hỷ, Phú Lương và Phú Bình trên cũng nằm trong các loài mà một số tác giảđã tìm thấy
ở Việt Nam. Tuy nhiên, sự phân bố của các loài sán lá và ký chủ trung gian của chúng phụ thuộc vào nhiều yếu tố; trong đó, các yếu tố tự nhiên (địa hình, khí hậu...) có liên quan đến sự phân bố của sán lá ruột.
3.1.2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà, vịt qua xét nghiệm phân
3.1.2.1 Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà qua xét nghiệm phân tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên
Bảng 3.2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà nuôi tại 3 huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên (qua xét nghiệm phân)
Địa điểm (Huyện) Số mẫu kiểm tra (mẫu) Số mẫu nhiễm (mẫu) Tỷ lệ nhiễm (%)
Cường độ nhiễm (số trứng/vi trường)
Nhẹ Trung bình Nặng Rất nặng n % n % n % n % Đồng Hỷ 247 38 15,38 24 63,16 9 23,68 4 10,53 1 2,63 Phú Lương 236 34 14,41 18 52,94 8 23,53 6 17,65 2 5,88 Phú Bình 264 50 18,94 28 56,00 10 20,00 8 16,00 4 8,00 Tính chung 747 122 16,33 70 57,38 27 22,13 18 14,75 7 5,74
Kết quả bảng 3.2 cho thấy: * Về tỷ lệ nhiễm:
Trong tổng số 747 mẫu phân kiểm tra có 122 mẫu nhiễm trứng sán lá ruột, tỷ
lệ nhiễm chung là 16,33%, biến động từ 14,41% - 18,94% tùy thuộc vào điều kiện chăn nuôi, công tác vệ sinh thú y, mức độ áp dụng các tiến bộ kỹ thuật của từng Huyện. Cụ thể:
-Trong 247 mẫu phân gà kiểm tra tại huyện Đồng Hỷ có 38 mẫu nhiễm trứng sán lá ruột, chiếm 15,38%.
-Có 34 mẫu phân gà nhiễm trứng sán lá ruột trong tổng số 236 mẫu kiểm tra tại huyện Phú Lương chiếm 14,41%.
-Có 50 mẫu phân gà nhiễm trứng sán lá ruột trong tổng số 264 mẫu kiểm tra tại huyện Phú Bình chiếm 18,94 %.
Như vậy, tỷ lệ nhiễm sán lá ruột ở gà nuôi tại các huyện nghiên cứu ớ mức tương đối thấp, điều này phản ánh tình hình nhiễm sán lá ruột ở gà tại tỉnh Thái Nguyên ở mức thấp.
Hình 3.1. Biểu đồ tỷ lệ nhiễm sán lá ruột ở gà tại các địa phương
Biểu đồ hình 3.1 minh hoạ rõ hơn về tỷ lệ nhiễm sán lá ruột ở gà tại các
địa phương.
* Về cường độ nhiễm
Tính chung trong tổng số 122 mẫu nhiễm có 70 mẫu nhiễm với cường độ nhẹ
chiếm tỷ lệ 57,38%, 27 mẫu nhiễm với cường độ trung bình chiếm 22,13%, 18 mẫu nhiễm ở cường độ nặng chiếm 14,75% và có 7 mẫu nhiễm ở cường độ rất nặng chiếm tỷ lệ 5,74%.
- Ở mức cường độ nhẹ: Huyện Phú Lương có tỷ lệ nhiễm thấp nhất với tỷ
lệ nhiễm là 52,94%, còn tỷ lệ nhiễm cao nhất là gà ở Huyện Đồng Hỷ chiếm tỷ lệ
63,16%.
- Ở mức cường độ trung bình: Huyện Phú Bình có tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 20% còn Đồng Hỷ có tỷ lệ nhiễm cao nhất là 23,68%.
- Ở mức cường độ nhiễm nặng: Gà nuôi ở Huyện Phú Lương có tỷ lệ nhiễm cao nhất 17,65% còn thấp nhất là Huyện Đồng Hỷ 10,53%.
- Ở mức cường độ nhiễm rất nặng: Huyện Phú Bình có tỷ lệ nhiễm cao nhất với 8% còn Huyện Đồng Hỷ là thấp nhất 2,63%.
Hình 3.2. Biểu đồ cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà tại các địa phương
Biểu đồ hình 3.2 minh hoạ rõ hơn về cường độ nhiễm sán lá ruột ở gà tại các
địa phương.
Như vậy, tỷ lệ nhiễm sán lá ruột gà tại 3 huyện nghiên cứu có sự chênh lệch không quá lớn. Tỷ lệ nhiễm khác nhau này phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưđịa hình, thời tiết khí hậu, điều kiện chăn nuôi, tình trạng vệ sinh thú y, ý thức về phòng bệnh giun sán của người chăn nuôi, mức độ áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật… Qua
điều tra thực tế chúng tôi thấy: tại các huyện này, các hộ dân vẫn còn tập quán chăn