3. Ý nghĩa của đề tài
1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, lần đầu tiên bệnh được phát hiện từ năm 1920. Cho đến nay, bệnh xảy ra ở hầu hết các tỉnh thành trên cả nước và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Trần Văn Nên và cs., 2016).
Ở nước ta, bệnh Care cũng được nhiêu nhà thú y quan tâm. Các nghiên cứu của các tác giả nhận thấy chó mắc bệnh Care sẽ xuất hiện các triệu chứng đặc trưng: sốt, viêm phổi, viêm ruột và các nốt sài ở vùng da mỏng. Cuối thời kỳ của bệnh, chó thường có triệu chứng thần kinh. Bệnh trở nên trầm trọng hơn do sự kế phát của vi khuẩn ký sinh sẵn có ở đường tiêu hóa, hô hấp. Bệnh Care thường biểu hiện ở hai dạng: viêm phổi và viêm ruột. Khi mắc bệnh Care con vật có biểu hiện sốt rất cao trên 40°C. Tất cả các giống và lứa tuổi đều mẫn cảm với bệnh sài sốt, tuy nhiên đối với giống chó ngoại và chó non thì chúng lại mẫn cảm hơn (Tô Du và Xuân Giao, 2006). Các nghiên cứu về bệnh mới chủ yếu tập trung về dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích và một số biến đối bệnh lý
của bệnh (Hồ Đình Chúc và cs., 1993; Lê Thị Tài, 2006; Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam, 2012; Nguyễn Thị Lan và Trần Trung Kiên, 2010).
Việc phân lập virus và nghiên cứu gen học hệ gen virus vẫn còn rất hạn chế. Năm 2008, một chủng virus Care (CDV-768) đã được nghiên cứu đặc tính sinh học và gây bệnh thực nghiệm (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015). Một số nghiên cứu khác cũng đã được thực hiện trong thời gian gần đây nhưng chỉ tập trung vào triệu chứng lâm sàng và bệnh lý (Nguyễn Thị Lan và cs., 2015; Trần Văn Nên và cs., 2016).
Cho đến nay đã có một số công bố về sinh học phân tử giải mã 01 hệ gen virus Care tại Việt Nam (Dung và cs., 2016). Khi so sánh về trình tự nucleotide ở gene H giữa 5 chủng virus nghiên cứu với nhau kết quả thu được chủng CDV-VNUA-768 có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA- 02H, CDVHUA-03R, CDV-HUA-04H và CDV-HUA-05P lần lượt là: 126, 131, 154, 16 vị trí. Chủng CDVHUA-02H có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-03R, CDV-HUA-04H và CDV-HUA-05P lần lượt là: 7, 153, 124 vị trí. Chủng CDV-HUA-03R có số lượng vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-04H và CDVHUA-05P lần lượt là 156 và 128 vị trí. Chủng CDV-HUA-04H có 154 vị trí sai khác so với chủng CDV-HUA-05P (Trần Văn Nên và cs., 2017).
Lan và cs. (2005), đã nghiên cứu thành công đặc tính sinh trưởng cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST). Qua đó, tác giả cũng chỉ ra tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus.
Năm 2018, Nguyễn Văn Dũng và cs. (2018) đã nghiên cứu và phát hiện gen H của CDV với các chủng phân lập là CDV/dog/HCM/33/140816 và CDV/dog/HCM/38/140827 được phân lập thành công từ 5 chủng được phát hiện toàn bộ gen H với các bệnh tích điển hình là tế bào nhiễm tạo thể hợp bào.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chó nghi mắc bệnh Care ở mọi lứa tuổi đã được kiểm tra dương tính bằng test thử nhanh One - step Canine Distemper Virus Ag test (IMMUNO).
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Thu nhận và giải trình tự toàn bộ gen H (gen kháng nguyên) của các mẫu virus CDV tại Hà Nội.
- Mẫu bệnh phẩm được thu thập từ các phòng khám thú ý tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm và Cầu Giấy - Hà Nội.
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm thu mẫu: một số phòng khám tại quận Cầu Giấy, Hà Đông và Nam Từ Liêm trên địa bàn Hà Nội
- Địa điểm phân tích mẫu: Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2019 đến tháng 8/2020
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận trên địa bàn Hà Nội
- Tình hình chó mắc bệnh Care tại một số quận ở Hà Nội
- Tỷ lệ chó mắc bệnh Care theo giống, theo lứa tuổi, theo mùa, theo nhóm đã được tiêm phòng và chưa được tiêm phòng vaccine
- Những triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care
2.2.2. Thu nhận mẫu bệnh phẩm nhiễm CDV
2.2.3. Thu nhận gen kháng nguyên H bằng kỹ thuật PCR 2.2.4. Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H 2.2.4. Giải trình tự nucleotide và amino acid của gen H
2.2.5. So sánh tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và amino acid của chủng CDV Việt Nam với các chủng của thế giới Việt Nam với các chủng của thế giới
2.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1.1. Nguyên liệu
Mẫu bệnh phẩm: gỉ mắt, gỉ mũi, phân, máu, thu nhận trên chó mắc bệnh Care ở mọi lứa tuổi (cho kết quả dương tính với kit thử nhanh) phân lập tại quận Hà Đông, Nam Từ Liêm và Cầu Giấy trên địa bàn TP Hà Nội.
2.3.1.2. Các dụng cụ và thiết bị
- Máy móc, dụng cụ và thiết bị dùng cho sinh học phân tử: thuộc phòng thí nghiệm của phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.1.3. Hóa chất
- Hoá chất: Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối (Prolabo - Pháp), đệm TAE (1X). Các mồi dùng cho phản ứng PCR, Macrogen (Hàn Quốc). Dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose.
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA của hãng Thermo (Mỹ). - Bộ kit Dream Taq PCR master mix (2X) để thực hiện phản ứng PCR của hãng Thermo (Mỹ).
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Thermo (Mỹ).
Bảng 2.1. Bộ mồi thu nhận gen H
Tên mồi Trình tự (5’….3’) Độ dài (nt) Vị trí trên hệ gen Chú thích C6863H-F GTCGATCCGRCATTTAAACCTG 22 6863-6885 Mồi cho phản ứng PCR C7950H-F TGACACTRGCTTCCTTGTGTG 21 7950-7971 Mồi giải trình tự C8250H-R TTCCCATGAYGTTYGGTTGC 20 8230-8250 Mồi giải trình tự C9071H-R ATTTGGGCTATCTAGATGGACC 22 9049-9071 Mồi cho phản ứng PCR
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Sơđồ nghiên cứu
Để thu nhận hệ gen virus chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo sơ đồ sau đây
Hình 2.1: Sơđồ nghiên cứu
2.3.2.2. Phương pháp khảo sát triệu chứng lâm sàng
Lập sổ theo dõi, ghi đầy đủ thông tin: lứa tuổi, giới tính, giống, địa phương, tình trạng tiêm phòng vaccine… thông qua chủ nuôi
Chó nghi mắc bệnh sẽ được khảo sát đầy đủ thông tin về triệu chứng lâm sàng ở: mắt, mũi, nôn mửa, tiêu chảy, gan bàn chân, nốt sài, biểu hiện thần kinh… Sau đó dùng test để kiểm tra và xác định chó mắc bệnh.
* Biểu hiện của chó nghi mắc bệnh: Chó ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn hoặc bỏ ăn. Con vật nôn ra bọt vàng, bọt trắng, thời gian nôn kéo dài. Chảy nước mũi, lâu dần sẽ thở gấp, thở khò khè. Tiêu chảy kéo dài, phân nhày, mùi tanh. Chó kiệt sức nhanh, co giật và chịu tác động trực tiếp vào hệ thần kinh. Mắt đục dần và có mủ, loét. Xuất hiện chấm đỏ ở bẹn và bụng dưới. Phân chuyển màu theo các giai đoạn bệnh cho tới khi ra máu tươi và chết.
Thu mẫu bệnh phẩm Tách chiết ARN tổng số Chuyển đổi cDNA Giải trình tự Tinh sạch sản phẩm PCR Tìm kiếm/so sánh/tìm cấu trúc gen Phân tích, xử lý chuỗi gen So sánh, đối chiếu, lập phả hệ Thực hiện phản ứng PCR
2.3.2.3. Phương pháp thu thập bệnh phẩm
Dùng tăm bông vô trùng lấy các mẫu bệnh phẩm (gỉ mắt, gỉ mũi, phân) thu nhận trên chó nghi mắc bệnh Care, sau đó cho vào túi nilon và buộc kín, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết.
Dùng xilanh lấy máu tĩnh mạch, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết. Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh và đem về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học.
2.3.2.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Mẫu bệnh phẩm được hòa tan lại trong 200 µl nước vô trùng trước khi dùng để tách chiết RNA tổng số.
RNA tổng số của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số
Bước 1 Bổ sung 350 µl RLT Working vào ống eppendorf 2ml sạch. Bước 2 Thêm 150 µl mẫu và lắc đều.
Bước 3 Bổ sung 350µl Ethanol 70%, lắc đều và đảo trộn.
Bước 4 Chuyển toàn bộ dịch lên cột, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.
Bước 5 Bổ sung 700µl dung dịch RW1, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ dịch phía dưới ống hứng.
Bước 6
Thêm 500µl RPE Working, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút và bỏ dịch dưới ống hứng. Làm khô cột bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 7
Bổ sung 30µl dịch Elution Buffer vào giữa màng lọc của cột, ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút để thu dịch.
Bước 8 Bảo quản RNA tổng số ở -800C cho đến khi sử dụng.
2.3.2.5. Phương pháp chuyển đổi cDNA
Reverse Transcriptase của hãng Fermentas. Phản ứng được thực hiện ở 500C trong 1 giờ, sau đó dừng phản ứng ở 800C trong 5 phút.
Sản phẩm cDNA được bảo quản -200C cho đến khi được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR thu nhận vùng gen H của virus. Thành phần phản ứng chuyển cDNA được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số
Thành phần Thể tích
ARN tổng số (100ng/µl) 2 µl
Primer Hexamer (100 picomol/µl) 1 µl
dNTP mix (10mM) 1 µl
H2O (nuclease-free) 10,5 µl
5X RT buffer 4 µl
RiboLock™Rnase Inhibitor (50U/µl) 0,5 µl Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl) 1 µl
Tổng 20 µl
2.3.2.6. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn cDNA thu vùng gen H của mẫu nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng bộ kit DreamTaq PCR Mastermix (2X) do hãng Thermo Scientific (Mỹ) cung cấp và phản ứng thực hiện trên máy PCR (PTC-100). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong bảng 2.4 và hình 2.2.
Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần PCR Thể tích
DreamTaq Mastermix (2X) 25 µl
Mồi xuôi (10pmol/µl) 2 µl
Mồi ngược (10pmol/µl) 2 µl
Khuôn cDNA 2 µl
DMSO 2 µl
Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Sản phẩm PCR được bảo quản ở -200C. Kết quả phản ứng PCR được đánh giá bằng điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Sản phẩm chất lượng tốt chúng sẽ được dùng để giải trình tự trực tiếp.
2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose
Nguyên lý: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính do có chứa gốc phosphat trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điện (pI) đặc trưng cho kích thước của mỗi loại phân tử acid nucleic. Các phân tử có trọng lượng cao di chuyển chậm hơn các phân tử có trọng lượng thấp. Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm gel trong Ethidium bromide và soi dưới tia cực tím.
Có 2 loại gel sử dụng trong kỹ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử là: Gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA.
Một trong các chất chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực khuẩn Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzym giới hạn HindIII thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb. Tuy nhiên, trên thực tế chỉ nhìn được 7 băng, còn băng có chiều dài
94oC 94oC 5 phút 30 giây 52oC 30 giây 72oC 72oC 3 phút 10 phút ∞ 35 chu kỳ 4oC
0,125kb thì rất khó phát hiện. Nhờ chỉ thị phân tử DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Lấy 0,4g bột thạch agarose nguyên chất cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE (1X). Cho vào lò vi sóng để agarose tan chảy hết (trong 3 phút). Để thạch bớt nóng (khoảng 600C) rồi đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào đổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm; để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội, các răng lược sẽ tạo thành các giếng để tra mẫu vào kiểm tra.
- Dìm ngập khuôn có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1x (đệm này cung cấp ion cho điện trường hoạt động)
- Tra mẫu: lấy 10µl sản phẩm trộn với 2 µl loading dye (6X), tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch.
- Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 5 µl chỉ thị phân tử (ADN marker) (ADN của thực khuẩn thể λ cắt bằng enzyme giới hạn
HindIII).
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 25 - 30 phút.
- Bổ sung 4µl ethidium bromide vào 40ml nước cất rồi bỏ thạch vào ngâm khoảng 10 phút.
- Rửa thạch sau đó đưa vào máy Dolphin Doc để soi và chụp ảnh.
2.3.2.8. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET Gel PCR Purification của hãng Thermo theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm được tinh sạch được dùng để giải trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa trước khi giải trình tự.
Các bước này thực hiện sau khi điện di trên thạch agarose 1% và cắt phần gel chứa sản phẩm DNA cần thu nhận.
Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR
Bước 1 Thêm dung dịch Binding Buffer vào ống có chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ 1 : 1 (w/v). Đun nóng ở 65°C cho đến khi gel tan hết.
Bước 2
Chuyển toàn bộ dung dịch thu được từ bước 1 vào cột tinh sạch GeneJET. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch phía dưới ống hứng.
Bước 3 Bổ sung 700 µl dung dịch rửa Wash Buffer, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ dịch phía dưới ống hứng. Bước 4 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn
dung dịch rửa. Bước 5
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml sạch.
Bổ sung 50 µl dung dịch Eluted Buffer, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 6 Thu dịch DNA, bảo quản ở -200C
2.3.2.9. Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm: bung liên kết, mồi bám và enzyme Taq-polymerase cùng các điều kiện thích hợp. Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20 đến 24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1%
dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiên). Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5’→ 3’ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc