3. Ý nghĩa của đề tài
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Sơđồ nghiên cứu
Để thu nhận hệ gen virus chúng tôi tiến hành các thí nghiệm theo sơ đồ sau đây
Hình 2.1: Sơđồ nghiên cứu
2.3.2.2. Phương pháp khảo sát triệu chứng lâm sàng
Lập sổ theo dõi, ghi đầy đủ thông tin: lứa tuổi, giới tính, giống, địa phương, tình trạng tiêm phòng vaccine… thông qua chủ nuôi
Chó nghi mắc bệnh sẽ được khảo sát đầy đủ thông tin về triệu chứng lâm sàng ở: mắt, mũi, nôn mửa, tiêu chảy, gan bàn chân, nốt sài, biểu hiện thần kinh… Sau đó dùng test để kiểm tra và xác định chó mắc bệnh.
* Biểu hiện của chó nghi mắc bệnh: Chó ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn hoặc bỏ ăn. Con vật nôn ra bọt vàng, bọt trắng, thời gian nôn kéo dài. Chảy nước mũi, lâu dần sẽ thở gấp, thở khò khè. Tiêu chảy kéo dài, phân nhày, mùi tanh. Chó kiệt sức nhanh, co giật và chịu tác động trực tiếp vào hệ thần kinh. Mắt đục dần và có mủ, loét. Xuất hiện chấm đỏ ở bẹn và bụng dưới. Phân chuyển màu theo các giai đoạn bệnh cho tới khi ra máu tươi và chết.
Thu mẫu bệnh phẩm Tách chiết ARN tổng số Chuyển đổi cDNA Giải trình tự Tinh sạch sản phẩm PCR Tìm kiếm/so sánh/tìm cấu trúc gen Phân tích, xử lý chuỗi gen So sánh, đối chiếu, lập phả hệ Thực hiện phản ứng PCR
2.3.2.3. Phương pháp thu thập bệnh phẩm
Dùng tăm bông vô trùng lấy các mẫu bệnh phẩm (gỉ mắt, gỉ mũi, phân) thu nhận trên chó nghi mắc bệnh Care, sau đó cho vào túi nilon và buộc kín, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết.
Dùng xilanh lấy máu tĩnh mạch, có đánh dấu và ký hiệu để nhận biết. Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh và đem về phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học.
2.3.2.4. Phương pháp tách chiết RNA tổng số
Mẫu bệnh phẩm được hòa tan lại trong 200 µl nước vô trùng trước khi dùng để tách chiết RNA tổng số.
RNA tổng số của virus được tách chiết bằng bộ sinh phẩm QIAamp Viral Mini Kit (QIAGEN Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:
Bảng 2.2: Các bước tách chiết RNA tổng số
Bước 1 Bổ sung 350 µl RLT Working vào ống eppendorf 2ml sạch. Bước 2 Thêm 150 µl mẫu và lắc đều.
Bước 3 Bổ sung 350µl Ethanol 70%, lắc đều và đảo trộn.
Bước 4 Chuyển toàn bộ dịch lên cột, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch phía dưới ống hứng.
Bước 5 Bổ sung 700µl dung dịch RW1, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút rồi bỏ dịch phía dưới ống hứng.
Bước 6
Thêm 500µl RPE Working, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút và bỏ dịch dưới ống hứng. Làm khô cột bằng cách ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 7
Bổ sung 30µl dịch Elution Buffer vào giữa màng lọc của cột, ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút để thu dịch.
Bước 8 Bảo quản RNA tổng số ở -800C cho đến khi sử dụng.
2.3.2.5. Phương pháp chuyển đổi cDNA
Reverse Transcriptase của hãng Fermentas. Phản ứng được thực hiện ở 500C trong 1 giờ, sau đó dừng phản ứng ở 800C trong 5 phút.
Sản phẩm cDNA được bảo quản -200C cho đến khi được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR thu nhận vùng gen H của virus. Thành phần phản ứng chuyển cDNA được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng chuyển đổi cDNA từ RNA tổng số
Thành phần Thể tích
ARN tổng số (100ng/µl) 2 µl
Primer Hexamer (100 picomol/µl) 1 µl
dNTP mix (10mM) 1 µl
H2O (nuclease-free) 10,5 µl
5X RT buffer 4 µl
RiboLock™Rnase Inhibitor (50U/µl) 0,5 µl Maxima Reverse Transcriptase (20U/µl) 1 µl
Tổng 20 µl
2.3.2.6. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trên khuôn cDNA thu vùng gen H của mẫu nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng bộ kit DreamTaq PCR Mastermix (2X) do hãng Thermo Scientific (Mỹ) cung cấp và phản ứng thực hiện trên máy PCR (PTC-100). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày trong bảng 2.4 và hình 2.2.
Bảng 2.4: Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần PCR Thể tích
DreamTaq Mastermix (2X) 25 µl
Mồi xuôi (10pmol/µl) 2 µl
Mồi ngược (10pmol/µl) 2 µl
Khuôn cDNA 2 µl
DMSO 2 µl
Hình 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Sản phẩm PCR được bảo quản ở -200C. Kết quả phản ứng PCR được đánh giá bằng điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%. Sản phẩm chất lượng tốt chúng sẽ được dùng để giải trình tự trực tiếp.
2.3.2.7. Phương pháp kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose
Nguyên lý: các acid nucleic mang điện tích âm trong môi trường pH trung tính do có chứa gốc phosphat trong cấu trúc hóa học, dưới tác dụng của điện trường không đổi chúng di chuyển về cực dương và dừng lại ở điểm đẳng điện (pI) đặc trưng cho kích thước của mỗi loại phân tử acid nucleic. Các phân tử có trọng lượng cao di chuyển chậm hơn các phân tử có trọng lượng thấp. Sản phẩm điện di được nhận biết nhờ nhuộm gel trong Ethidium bromide và soi dưới tia cực tím.
Có 2 loại gel sử dụng trong kỹ thuật điện di nghiên cứu di truyền và sinh học phân tử là: Gel agarose sử dụng trong các máy điện di và gel polyacrylamide sử dụng phân tách các phân tử acid nucleic kích thước nhỏ trong giải trình tự DNA.
Một trong các chất chỉ thị phân tử DNA thường được dùng là DNA của thực khuẩn Lambda, dài 43kb được cắt bằng enzym giới hạn HindIII thành 8 phân đoạn có độ dài: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb; 0,125kb. Tuy nhiên, trên thực tế chỉ nhìn được 7 băng, còn băng có chiều dài
94oC 94oC 5 phút 30 giây 52oC 30 giây 72oC 72oC 3 phút 10 phút ∞ 35 chu kỳ 4oC
0,125kb thì rất khó phát hiện. Nhờ chỉ thị phân tử DNA có thể xác định được chiều dài đoạn DNA cần nghiên cứu.
- Chuẩn bị gel agarose 1%: Lấy 0,4g bột thạch agarose nguyên chất cho vào cốc đong thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE (1X). Cho vào lò vi sóng để agarose tan chảy hết (trong 3 phút). Để thạch bớt nóng (khoảng 600C) rồi đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào đổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm; để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội, các răng lược sẽ tạo thành các giếng để tra mẫu vào kiểm tra.
- Dìm ngập khuôn có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1x (đệm này cung cấp ion cho điện trường hoạt động)
- Tra mẫu: lấy 10µl sản phẩm trộn với 2 µl loading dye (6X), tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch.
- Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 5 µl chỉ thị phân tử (ADN marker) (ADN của thực khuẩn thể λ cắt bằng enzyme giới hạn
HindIII).
- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong khoảng 25 - 30 phút.
- Bổ sung 4µl ethidium bromide vào 40ml nước cất rồi bỏ thạch vào ngâm khoảng 10 phút.
- Rửa thạch sau đó đưa vào máy Dolphin Doc để soi và chụp ảnh.
2.3.2.8. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET Gel PCR Purification của hãng Thermo theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm được tinh sạch được dùng để giải trình tự trực tiếp hoặc dòng hóa trước khi giải trình tự.
Các bước này thực hiện sau khi điện di trên thạch agarose 1% và cắt phần gel chứa sản phẩm DNA cần thu nhận.
Bảng 2.5: Các bước tinh sạch sản phẩm PCR
Bước 1 Thêm dung dịch Binding Buffer vào ống có chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ 1 : 1 (w/v). Đun nóng ở 65°C cho đến khi gel tan hết.
Bước 2
Chuyển toàn bộ dung dịch thu được từ bước 1 vào cột tinh sạch GeneJET. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ phần dịch phía dưới ống hứng.
Bước 3 Bổ sung 700 µl dung dịch rửa Wash Buffer, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30-60 giây. Loại bỏ dịch phía dưới ống hứng. Bước 4 Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn
dung dịch rửa. Bước 5
Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml sạch.
Bổ sung 50 µl dung dịch Eluted Buffer, để nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút.
Bước 6 Thu dịch DNA, bảo quản ở -200C
2.3.2.9. Phương pháp giải trình tự
Phương pháp giải trình tự (sequencing) dựa vào hoạt động của enzyme DNA-polymerase trong quá trình tổng hợp DNA, emzym DNA-polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3’ có chứa nhóm -OH tự do, khi gặp nucleotide không chứa nhóm 3’-OH (ddNTP) thì phản ứng tổng hợp dừng lại. Đặc trưng của phương pháp này là dùng ddNTP (bị mất 2 nguyên tử oxy ở vị trí cacbon 3 và 4) để dừng phản ứng một cách ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra các đoạn DNA sợi đơn dài ngắn khác nhau và chỉ sai khác nhau một nucleotide.
Kỹ thuật này kết hợp ba bước của một chu kỳ nhiệt phản ứng PCR, bao gồm: bung liên kết, mồi bám và enzyme Taq-polymerase cùng các điều kiện thích hợp. Mồi sử dụng là mồi đơn dài khoảng 20 đến 24 nucleotide, thành phần tổng hợp DNA là hai loại NTP bao gồm deoxy NTP (dNTP) và 1%
dideoxy NTP (ddNTP) tương ứng (lượng nhỏ ddNTP so với dNTP nên thỉnh thoảng mới có 1 ddNTP được sử dụng để làm cho phản ứng nối dài chuỗi đơn nucleotide dừng lại ngẫu nhiên). Chuỗi DNA sản phẩm được xác định trình tự theo chiều 5’→ 3’ dùng thuốc nhuộm huỳnh quang (fluorescent dye) để đánh dấu, sử dụng thạch polyacrylamide và quét tia lazer dọc theo chuỗi để đọc trình tự, phân tích tự động bằng máy với các chương trình phần mềm tin - sinh học.
Chuỗi DNA cuối cùng thu nhận được bao giờ cũng được xác định theo chiều 5’→3’. Mỗi một lần giải trình tự, chuỗi thô (chuỗi có thành phần DNA ban đầu chưa được xử lý) có độ dài khoảng vài trăm đến vài nghìn nucleotide; thông thường là 500 - 1000 nucleotide nếu được giải trình trên máy giải trình trình tự tự động.
2.3.2.10. Phương pháp xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin - sinh học
Trình tự DNA thu nhận được từ máy giải trình tự, được cung cấp ở hai dạng: chuỗi nucleotide thô ở dạng chữ (.txt) và chuỗi nucleotide thô ở dạng giản đồ chromatogram (.ab1). Chuỗi ở dạng .txt cho phép nhận biết chuỗi giải trình tự có đạt yêu cầu không, còn chuỗi nucleotide ở dạng .ab1 cho phép đưa vào các chương trình chuyên biệt (ví dụ: Chromas, BioEdit, SeqEd) để phân tích, biên tập với mục đích xác định chính xác từng nucleotide để có chuỗi cuối cùng (chuỗi tinh hay chuỗi đã biên tập). Cuối cùng, chuỗi đã được biên tập (edition) được sử dụng ở dạng .txt, vì ở dạng này, tất cả các chương trình phân tích gen (ví dụ: MEGA, GeneDoc, MacVector) đều có thể nhận biết.
* Chương trình so sánh và phân tích chuỗi gen - GeneDoc
GeneDoc là một chương trình nổi (interface application) được lập trình cho máy tính PC sử dụng hệ Window, dùng để mở file, đọc và phân tích file ở dạng .msf (multiple sequence file) (Nicholas KB và Nicholas HB, 1999), GeneDoc cho phép xác định trình tự amino acid của gen nhân và gen ty thể,
đưa ra cấu hình của các chuỗi đã được so sánh để chuyển nạp vào MEGA cho phân tích phả hệ. Trong nghiên cứu sử dụng chương trình GeneDoc 2.7.
* Chương trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA)
MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) là một hệ chương trình nổi giao diện (interface application) được lập trình dễ sử dụng cho các nhà nghiên cứu di truyền học phân tử với mục đích so sánh đối chiếu các chuỗi gen đồng chức năng từ các chủng cùng loài, từ các chủng khác loài trong cùng giống/chi thuộc cùng một họ từ đó suy ra mối quan hệ nguồn gốc và phả hệ ở góc độ tiến hóa phân tử (Tamura và cs., 2013). Trong nghiên cứu sử dụng chương trình MEGA 7.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả về tình hình chó mắc bệnh Care tại một số Quận trên địa bàn Hà Nội