2.4.1. Phương pháp bố trí theo dõi xác định loài Leucocytozoon ký sinh ở gà tại Lạng Sơn
Các tiêu bản máu sau khi xét nghiệm thấy có đơn bào đường máu ký sinh, chúng tôi tiến hành phân loại theo căn cứ vào hình thái của các loại đơn bào đã phát hiện được theo khóa định loại của Levine N. D. (1985); Martinsen E. S. và cs (2008).
2.4.2. Bố trí lấy mẫu và phương pháp xác định tỷ lệ, cường độ nhiễm Leucocytozoon ở gà Leucocytozoon ở gà
2.4.2.1. Bố trí thu thập mẫu
Bố trí lấy mẫu máu gà theo phương pháp chọn mẫu ngẫu nhiên, mẫu chùm 3 bậc. (Nguyễn Như Thanh (2001)).
Chọn 2 huyện, mỗi huyện chọn 5 xã, mỗi xã chọn 5 thôn, mỗi xã lấy 50 mẫu ngẫu nhiên ở các thôn.
Mỗi gà làm 3 tiêu bản máu.
2.4.2.2. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm Lecocytozoon ở gà tại các địa phương
* Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu máu được thu thập ngẫu nhiên từ gà nuôi thả vườn tại các nông hộ, các trại chăn nuôi gà ở các địa phương của huyện Cao Lộc và Huyện Hữu Lũng, tỉnh Lạng Sơn.
Chuẩn bị những phiến kính mới đã được tẩy mỡ bằng cách ngâm và rửa xà phòng, sau đó ngâm trong cồn 960 trong 3 giờ rồi lau khô bằng khăn mềm không có xơ. Đồng thời, chọn những lamen kích thước 2 x 2 cm, rìa thật phẳng và nhẵn.
Trước khi lấy mẫu máu xét nghiệm, quan sát kỹ các biểu hiện lâm sàng của gà. Dùng kim lấy 1 giọt máu tươi của gà tại tĩnh mạch cánh, đặt lên phiến kính, cách bờ phiến kính khoảng 1 cm. Đặt cạnh của một lamen lên giọt máu, nghiêng 450 với phiến kính. Khi giọt máu đã tràn ra khắp cạnh của lamen thì đẩy lamen về phía trước, làm cho máu được dàn thành một lớp mỏng và đều trên phiến kính. Cố định tiêu bản bằng cồn methanol. Làm 3 tiêu bản máu/ gà. Tiêu bản được ghi số thứ tự bằng bút chì mỡ. Ghi nhật ký thí nghiệm các thông tin: chủ hộ, địa chỉ, ngày lấy mẫu, tuổi gà, phương thức chăn nuôi, trạng thái và màu sắc phân, điều kiện vệ sinh thú y, các biểu hiện lâm sàng (nếu có).
* Chuẩn bị thuốc nhuộm giemsa cơ bản
Dung dịch giemsa cơ bản bao gồm: - Giemsa bột: 3,8 gam
- Cồn etylic tuyệt đối: 375 ml - Glycerin: 125 ml
Dùng đũa thủy tinh khuấy kỹ rồi để vào tủ ấm 37oC với thời gian 48 h, sau đó lọc qua giấy lọc, bỏ cặn và bảo quản trong lọ thủy tinh màu trung tính, có nút kín.
* Phương pháp nhuộm giemsa
Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) cho biết: Nhuộm tiêu bản máu bằng thuốc nhuộm giemsa gồm 3 bước như sau:
- Bước 1: Pha thuốc nhuộm giemsa + Giemsa cơ bản: 1 phần
+ Nước cất trung tính (pH = 7,2): 9 phần
Nước cất để sẵn trong 1 cốc nhỏ có mỏ (100 ml), lấy dung dịch giemsa cơ bản bằng 1 pipet, nhỏ chậm giemsa vào cốc nước, không được lắc cốc.
- Bước 2: Đổ chậm dung dịch nhuộm vào hộp nhuộm cho ngập các tiêu bản, đậy nắp hộp nhuộm để tránh bụi
- Bước 3: lấy tiêu bản
Dùng 1 pince kẹp, cặp lần lượt từng tiêu bản và để nghiêng dưới vòi nước cất chảy nhẹ (pH = 7,2) cho trôi hết thuốc nhuộm dư thừa. Sau đó dựng nghiêng tiêu bản vào cạnh 1 cái hộp, để khô tự nhiên.
* Phương pháp kiểm tra tìm Leucocytozoon trên tiêu bản máu nhuộm giemsa
Nhỏ 1 giọt dầu bạch dương lên tiêu bản, kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi vật kính dầu, độ phóng đại 10 x 90 hoặc 10 x 100 để tìm
Leucocytozoon.
Những mẫu máu tìm thấy đơn bào Leucocytozoon được xác định là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
Cường độ nhiễm được xác định bằng tỷ lệ % số hồng cầu có đơn bào ký sinh và quy định các mức cường độ nhiễm: nhẹ, trung bình và nặng.
Nhiễm mức độ nhẹ: ≤ 5% số hồng cầu có đơn bào ký sinh, đồng thời gà không có biểu hiện lâm sàng.
Nhiễm mức độ trung bình: > 5% - 10% số hồng cầu có đơn bào ký sinh, đồng thời gà có một số triệu chứng lâm sàng nhưng chưa rõ rệt.
Nhiễm mức độ nặng: > 10% số hồng cầu có đơn bào ký sinh, đồng thời gà có triệu chứng lâm sàng rõ rệt.
2.4.2.3. Quy định một số yếu tố dịch tễ liên quan đến tình hình nhiễm đơn bào Leucocytzoon ở gà
* Mùa: Thu thập 500 mẫu máu gà tại các địa phương theo các mùa trong năm, số lượng mẫu thu thập theo từng mùa như sau:
- Mùa Xuân (từ tháng 2 đến tháng 4) - Mùa Hè (từ tháng 5 đến tháng 7) -Mùa Thu (từ tháng 8 đến tháng 10)
- Mùa Đông (từ tháng 11 đến tháng 01 năm sau)
≤ 2 tháng tuổi > 2 – 4 tháng tuổi > 4 – 6 tháng tuổi > 6 tháng tuổi
* Tình trạng vệ sinh thú y: Thu thập mẫu máu gà tại các địa phương theo các tình trạng VSTY như sau:
- VSTY tốt: chuồng trại cao ráo, thoáng mát, sạch sẽ, thường xuyên quyét dọn chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi và bãi chăn thả, định kỳ phun thuốc khử trùng, thuốc diệt muỗi, dĩn, tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, phát quang cây cỏ, khơi thông cống rãnh.
- VSTY trung bình: không thường xuyên quét dọn chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi, bãi chăn thả còn có những vũng nước đọng, thỉnh thoảng phun thuốc diệt muỗi, dĩn; không thường xuyên tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và phát quang cây cỏ, không thường xuyên khơi thông cống rãnh ở gần khu vực chăn nuôi.
- VSTY kém: Chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi và bãi chăn thả ẩm thấp, có nhiều vũng nước đọng, có nhiều bụi cây rậm rạp, không tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, không khơi thông cống rãnh.
2.4.3. Phương pháp xác định quy luật hoạt động của dĩn – véc tơ truyền bệnh Leucocytozoon cho gà Leucocytozoon cho gà
* Phương pháp xác định quy luật hoạt động theo các tháng trong năm
Theo dõi sự xuất hiện và hoạt động của dĩn để xác định quy luật hoạt động của dĩn ở tất cả các tháng trong năm, từ đó xác định được tháng dĩn bắt đầu hoạt động, những tháng dĩn hoạt động mạnh và những tháng dĩn ngừng hoạt động. Kết quả này sẽ là cơ sở khoa học khuyến cáo người chăn nuôi có biện pháp diệt dĩn – véc tơ truyền Leucocytozoon cho gà phù hợp, hạn chế tác hại do bệnh Leucocytozoon gây ra ở gà.
Những tháng dĩn hoạt động nhiều được kí hiệu (+++), tháng dĩn hoạt động bình thường thì ký hiệu (++), tháng dĩn hoạt động ít thì ký hiệu (+), dĩn ngừng hoạt động ký hiệu (-).
* Phương pháp xác định quy luật hoạt động theo giờ trong ngày
Qua theo dõi, chúng tôi thấy dĩn hoạt động nhiều vào thời gian từ tháng 4 đến tháng 9 hàng năm. Do vậy, chúng tôi tiến hành theo dõi sự hoạt động theo giờ trong ngày của dĩn ở các tháng này. Thời gian trong ngày chia theo các khoảng như sau: từ 6 – 8 h, 8 – 11 h, 11 – 13 h, 13 – 16 h, 16 – 18 h.
Những khoảng thời gian trong ngày dĩn hoạt động nhiều được kí hiệu (+++), hoạt động bình thường thì ký hiệu (++), hoạt động ít ký hiệu (+), ngừng hoạt động ký hiệu (-).
2.4.4. Phương pháp bố trí theo dõi và xác định đặc điểm bệnh lý, lâm sàng bệnh Leucocytozoon ở gà bệnh Leucocytozoon ở gà
2.4.4.1. Phương pháp xác định những biến đổi lâm sàng của gà
Theo dõi tất cả những gà có kết quả kiểm tra tiêu bản máu dương tính với đơn bào Leucocytozoon.
Xác định những biến đổi lâm sàng của gà bệnh bằng cách trực tiếp quan sát: mào, tích, thể trạng, phân, ăn uống, vận động... kết hợp với hỏi chủ hộ nuôi gà.
2.4.4.2. Bố trí lấy mẫu và phương pháp xét nghiệm một số chỉ số máu của gà khỏe và gà bị bệnh
* Bố trí lấy mẫu xét nghiệm
Dự kiến xét nghiệm lấy mẫu máu của 10 gà khỏe và 10 gà bị bệnh đơn bào Leucocytozoon.
Lấy máu gà ở tĩnh mạch cánh (2 ml/ con) vào ống nghiệm có tráng dung dịch EDTA 1% để chống đông máu.
* Phương pháp xét nghiệm một số chỉ số máu của gà khỏe và gà bị bệnh Leucocytozoon:
- Số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, số lượng tiểu cầu, hàm lượng huyết sắc tố và công thức bạch cầu được xác định trên máy Cellta - Mek - 6420k - Nihon Kohden (Nhật Bản).
- Thời gian đông máu được xác định bằng phương pháp sau: chuẩn bị một lam kính khô, sạch, không mỡ, nhỏ lên lam kính một giọt máu tươi và ghi lại thời gian. Sau đó, cứ 30 giây lấy đầu kim vạch lên giọt máu, nếu giọt máu xuất hiện sợi tơ nhỏ thì từ khi nhỏ giọt máu lên phiến kính cho đến thời điểm đó được tính là thời điểm đông máu (Chu Đức Thắng và cs., 2008).
2.4.4.3. Phương pháp xác định những tổn thương ở phủ tạng và cơ của gà, tỷ lệ cơ quan nội tạng có đơn bào Leucocytozoon ký sinh
* Phương pháp bố thí theo dõi
Theo dõi trên những gà có triệu chứng của bệnh và khi xét nghiệm máu thấy có Leucocytozoon trong máu ở cường độ nặng.
*Phương pháp xác định bệnh tích đại thể
Mổ khám gà theo hướng dẫn của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn (2016), để xác định những biến đổi đại thể ở các phủ tạng và cơ do đơn bào Leucocytozoon gây ra.
Quan sát bằng mắt thường và kính lúp cơ và các nội quan như thận, lách, tim, phổi, ruột... Ghi lại những tổn thương quan sát được của gà mổ khám.
Chụp ảnh vùng có bệnh tích điển hình.
* Phương pháp xác định bệnh tích vi thể
Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin, đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh bằng máy ảnh kỹ thuật số các hình ảnh dưới kính hiển vi, gồm các bước sau:
Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm
Bước 2: Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch formol 10% Bước 3: Tẩy nước làm trong
Bước 5: Đúc Block
Bước 6: Cắt và dán mảnh Bước 7: Nhuộm tiêu bản
Bước 8: Dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại từ 200 - 400 lần
* Phương pháp xác định tỷ lệ cơ quan nội tạng của gà có đơn bào ký sinh
Xác định tỷ lệ cơ quan nội tạng có đơn bào ký sinh bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học và đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học (Jones T. C. và Gleiser C. A. (1954)).
2.4.5. Phương pháp đánh giá hiệu lực và độ an toàn của 02 phác đồ điều trị
bệnh Leucocytozoon cho gà
* Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm sử dụng 2 phác đồ điều trị cho những gà có kết quả xét nghiệm máu là nhiễm Leucocytozoon theo sơ đồ sau:
Diễn giải Lô 1 Lô 2 Số gà thí nghiệm 30 30 Phác đồ sử dụng và liều lượng - Trimethoxin wsp (1g/ 1,5 lít nước) - TOP-PHOSRETIC
(Giải độc gan) (1g/1 lít nước) - TOP-C 20% (1g/ 2 lít nước) - Vitamino (1ml/ 2 lít nước) - Paradol K + C (hạ sốt) (1g/ 2 lít nước) - SU 99 (1g/ 5 lít nước) - TOP-PHOSRETIC
(Giải độc gan) (1g/1 lít nước) - TOP-C 20% (1g/ 2 lít nước) - Vitamino (1ml/ 2 lít nước) - Paradol K + C (hạ sốt) (1g/ 2 lít nước) Liệu trình (ngày) 10 10
* Thành phần thuốc có trong các phác đồđiều trị như sau:
Trimethoprim 10g Tá dược vừa đủ 100g
- SU 99: Sulfamonomethoxine Sodium 99g Tá dược vừa đủ 100gam
- TOP-PHOSRETIC (Giải độc gan): Vitamin A (min) 500.000 UI Vitamin K3 (min) 500mg
- TOP-C 20%: Vitamin C (min) 200.000 mg Độ ẩm (max) 10%
Tá dược vừa đủ 1kg
- Vitamino: Vitamin E (min) 4.000 IU Methionine (min) 10.000 mg
- Paradol K + C (hạ sốt): Paracetamol 20g Vitamin C 10g
Tá dược vừa đủ 100g
* Phương pháp xác định hiệu lực và độ an toàn của phác đồ điều trị
Sử dụng 2 phác đồ điều trị cho những gà bị bệnh Leucocytozoon. Sau khi cho gà uống thuốc, hàng ngày lấy máu xét nghiệm bằng phương pháp dàn tiêu bản máu, nhuộm Giemsa, kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định hiệu quả của từng phác đồ điều trị. Tiếp tục theo dõi như vậy đến ngày thứ 10 sau dùng thuốc, nếu không tìm thấy đơn bào Leucocytozoon trong máu thì đánh giá thuốc có hiệu lực triệt để đối với Leucocytozoon, nếu vẫn tìm thấy Leucocytozoon trong máu nhưng với số lượng giảm rõ rệt thì đánh giá thuốc có hiệu lực với Leucocytozoon nhưng chưa triệt để. Nếu số lượng Leucocytozoon trong máu không giảm hoặc giảm không đáng kể so với trước khi dùng thuốc thì đánh giá thuốc không có hiệu lực với
Leucocytozoon.
Theo dõi gà sau dùng thuốc về các chỉ tiêu: ăn uống, vận động, màu sắc mào yếm, và các phản ứng khác để xác định thuốc có an toàn hay không.
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học (Nguyễn Văn Thiện, 2008) và trên phần mềm Minitab 14.0.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần loài đơn bào Leucocytozoon gây bệnh ở gà tại Lạng Sơn
Để xác định loài đơn bào Leucocytozoon gây bệnh cho gà thả vườn tại huyện Hữu Lũng và huyện Cao Lộc, tỉnh Lạng Sơn, chúng tôi đã làm tiêu bản máu, nhuộm Giemsa, đọc kết quả dưới kính hiển vi. Căn cứ theo mô tả của Levine N. D. (1985); Martinsen E. S. và cs (2008) về hình thái của các loài đơn bào, chúng tôi đã xác định được 01 loài đơn bào ký sinh và gây bệnh cho gà tại 2 huyện của tỉnh Lạng Sơn. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1. Thành phần loài Leucocytozoon gây bệnh ở gà tại Lạng Sơn
Địa phương (huyện) Loài Leucocytozoon Số loài phát hiện L. caulleryi Loài khác Huyện Cao Lộc + - 1 Huyện Hữu Lũng + - 1 Tần suất xuất hiện (%) 100 0 1 Bảng 3.1 cho thấy:
Đã định danh được 01 loài đơn bào thuộc giống Leucocytozoon gây bệnh cho gà tại huyện Cao Lộc và huyện Hữu Lũng tỉnh Lạng Sơn, đó là loài L. caulleryi. Loài L. caulleryi phân bố rộng rãi và phổ biến, xuất hiện ở tất cả các địa phương nghiên cứu. Trong các mẫu định loài tại hai địa phương này không thấy xuất hiện các loài Leucocytozoon khác.
Loài đơn bào thấy ở huyện Hữu Lũng và huyện Cao Lộc, tỉnh Lạng Sơn có vị trí phân loại như sau:
Loài Leucocytozoon caulleryi (Mathis et Leger, 1909) thuộc giống
Leucocytozoon (Sambon, 1908), họ Leucocytozoidae (Doflein, 1916), bộ Haemosporoda (Jacques Euzéby, 1988), lớp Aconoidasida (Mehlhorn, 1980), ngành Apicomplexa (Levine, 1970).
Loài L. caulleryi: Đơn bào có dạng hình cầu, khi ký sinh trong tế bào hồng cầu của gà, đơn bào này luôn làm cho nhân hồng cầu lệch sang một bên và hồng cầu của gà có hình gần tròn.
Hình thái của loài đơn bào mà chúng tôi phát hiện được trên gà ở Lạng Sơn hoàn toàn phù hợp với mô tả của Levine N. D. (1985); Martinsen E. S. và cs (2008).
Khi tiến hành định danh loài đơn bào ký sinh và gây bệnh cho gà tại tại tỉnh Phúc Kiến, Trung Quốc, Wenting Zhao và cs. (2015) đã kiểm tra hình thái của đơn bào Leucocytozoon trên tiêu bản máu thu thập ở gà, thấy có hai loài đơn bào là L. sabrazesi và L. caulleryi. Theo tác giả, loài L. caulleryi có hình tròn. Khi định danh loài đơn bào Leucocytozoon tại tỉnh Lạng Sơn, chúng tôi cũng thấy loài đơn bào trên có hình thái phù hợp với mô tả của Wenting Zhao và cs. (2015).
Theo Phạm Sỹ Lăng (2010): Ở Việt Nam có 4 loài Leucocytozoon ký sinh và gây bệnh chủ yếu cho đàn gà là L. caulleryi, L. sabrazesi, L. simondi và L. smithi. Kết quả nghiên cứu trên những mẫu máu gà thu thập tại 2 huyện thuộc tỉnh Lạng Sơn chỉ thấy xuất hiện 1 loài đơn bào ký sinh và gây bệnh cho gà là L. caulleryi.
Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2012), ngoài ký sinh trong hồng cầu, đôi khi còn thấy đơn bào Leucocytozoon ký sinh trong bạch cầu của gà. Tuy nhiên, trên những tiêu bản máu gà kiểm tra tại các địa phương của tỉnh Lạng Sơn, chúng tôi chỉ phát hiện thấy đơn bào
Leucocytozoon ký sinh trong hồng cầu, không thấy tiêu bản nào có đơn bào Leucocytozoon ký sinh trong bạch cầu.
3.2. Một sốđặc điểm dịch tễ bệnh đơn bào Leucocytozoonở gà tại Lạng Sơn Lạng Sơn
3.2.1. Tình hình nhiễm đơn bào đường máu Leucocytozoon ở gà
3.2.1.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon ở gà theo địa phương