2.6.4.1. Phương phâp xĩt nghiệm bằng phản ứng 3ABC-ELISA
* Nguyín lý: Dùng khâng thể hoặc khâng khâng thể gắn enzyme, rồi cho kết
hợp trực tiếp hoặc giân tiếp với khâng nguyín, sau đó cho cơ chất văo, cơ chất bị enzyme phđn huỷ tạo mău vă khi so mău trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ phản ứng.
* Nguyín liệu: Cung cấp trong bộ Kít, bộ Kít chẩn đoân KIT PARA vă câc
dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thí nghiệm.
* Nguyín liệu hóa học:
- Dung dịch pha loêng mẫu (Sample Dilutions): Một lọ 300ml
- Conjugate: Một lọ 60 ml được cung cấp sẵn trong bộ Kít. Dung dịch năy không pha loêng.
- Nước rửa: Pha loêng 1/10 trong nước cất 2 lần, nước rửa năy có thể giữ 1 tuần ở nhiệt độ 22 ± 3o
C.
- Chất phât mău – substrate TMB N.12: Một lọ chứa 600ml substrate TMB N.12. - Dung dịch dừng phản ứng: Một lọ chứa 100ml.
* Nguyín liệu sinh học
- Đối chứng dương tính: Một lọ chứa 0,4 ml. - Đối chứng đm tính: Một lọ chứa 0,4 ml.
- Đĩa ELISA được gắn khâng nguyín 3ABC: 5 đĩa
* Chuẩn bị mẫu
- Kiểm tra tình trạng mẫu;
- Nếu mẫu huyết thanh còn lẫn mâu thì phải xử lý mẫu trước khi lăm phản ứng bằng câch li tđm mẫu ở 1000g trong 15 phút để lăm sạch huyết thanh.
- Sau khi xử lý, mẫu được giữ tạm ở +4°C vă ghi lại kí hiệu mẫu.
* Câc bước tiến hănh
Tất cả câc nguyín liệu đưa về nhiệt độ phòng 22 ±3oC khoảng 20 phút vă lắc đều trước khi sử dụng.
- Pha loêng mẫu với tỷ lệ: 1/100 vă đối chứng huyết thanh dương vă đối chứng huyết thanh đm.
- Chuyển 100µl dung dịch mẫu đê pha loêng, đối chứng huyết thanh dương vă đối chứng huyết thanh đm văo câc giếng của đĩa ELISA đê được bố trí.
- Dân kín đĩa bằng miếng dân có sẵn trong bộ kít vă ủ đĩa ở nhiệt độ 37oC ± 3 thời gian 60 phút ± 10 (trong hộp giữ ẩm).
- Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa (300µl/giếng). - Cho 100 µl conjugate văo tất cả câc giếng của đĩa ELISA.
- Dân kín đĩa bằng miếng dân có sẵn trong bộ kít vă ủ đĩa ở nhiệt độ 37oC ± 3 thời gian 60 phút ± 10 (trong hộp giữ ẩm).
- Rửa đĩa phản ứng 3 lần bằng dung dịch rửa (300µl/giếng).
- Cho 100µl TMB (chất phât mău) văo tất cả câc giếng. Ủ ở nhiệt độ 18 - 26oC thời gian 15 phút ± 1.
- Cho 100µl dung dịch Stop văo tất cả câc giếng lắc đều trước khi cho văo mây đọc.
- Đọc kết quả phản ứng bằng mây đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
* Đânh giâ kết quả:
Giâ trị mật độ quang (OD) của mỗi giếng được đọc ở bước sóng 450nm, sau khi mău phât triển đê được dừng lại.
Tính toân giâ trị tỷsuất mật độ quang của từng mẫu (so với đối chứng dương) được tính theo công thức:
Giâ trịtỷ suất mật độ quang của mẫu(%OD)=
ODsple-ODneg
× 100 ODpos- ODneg
Trong đó: ODsple:giâtrị mật độ quang của mẫu xĩt nghiệm, ODpos:giâtrị mật độ quang của đối chứng dương, ODneg:giâtrị mật độ quang của đối chứng đm. Nếu OD ≥ 30%kết quả được coi lă dương tính
Nếu OD < 20% kết quả được coi lă đm tính
* Sơ đồ bố trí phản ứng trín một khay ELISA như sau: A N N 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39 B P P 8 8 ... ... ... ... ... ... ... ... C 1 1 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... D 2 2 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... E 3 3 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... F 4 4 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G 5 5 ... ... ... ... ... ... ... ... 45 45 H 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38 46 46 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ghi chú: Trong mỗi khay 8 dêy mỗi dêy 12 lỗ giếng 46 mẫu huyết thanh (đânh số từ 1 đến 46) được xĩt nghiệm, mỗi mẫu được lăm lặp lại (2 lần) để lấy giâ trị OD trung bình song song với từng cặp đối chứng đm (N) vă đối chứng dương (P).
3.6.4.2. Phương phâp xĩt nghiệm bằng phương phâp RT-PCR
* Nguyín liệu hóa học
- Dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS)
Thănh phần Số lượng
NaC1 8,0 g
KC1 0,2 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g
Lượng hóa chất trín được cho văo bình thủy tinh, cho nước cất 2 lần văo để đủ 1 lít, khuấy tan hoăn toăn, hấp cao âp tiệt trùng (Autoclave) 110C trong15 phút vă điều chỉnh pH 7,3 ± 0,1.
- Ethanol 90%,70%;
- Dung dịch chiết tâch theo bộ kit InviMAG Virus RNA Kit KFFlex96 Catalogue Number: 7443300200;
- Hóa chất tạo MasterMix theo QIAGEN®OneStep RT-PCR Kit, Catalogue Number: 210212;
- Hóa chất tạo MasterMix theo Invitrogen SuperScript® III Platinum® One- Step Quantitative RT-PCR System, Catalogue Number: 11732-020.
*Nguyín liệu sinh học
- Đoạn mồi (primers) vă Đoạn dò (probe)
- Đối chứng dương: Chia nhỏ văo câc tube 0,5 ml, dân nhên vă giữ ở tủ lạnh -80oC.
* Chuẩn bị Master Mix
- Trước khi văo phòng Master Mix phải tính thể tích của từng loại nguyín liệu cho số mẫu xĩt nghiệm sẽ thực hiện theo nguyín tắc: N phản ứng = số mẫu xĩt nghiệm+ 02 mẫu đối chứng+ 01 mẫu hao hụt.
Kết quả tính phải được ghi văo cột thể tích cho N phản ứng (µl) văo phiếu rồi mang văo phòng Master Mix để thực hiện.
- Dùng cồn 70 độ để vệ sinh micropipette, mặt bằng lăm việc trong PCR Cabinet. - Kiểm tra số lượng câc loại tip micropipette.
- Chuẩn bị “cool box” để chứa câc tube nguyín liệu, tube master mix, đĩa PCR 96 giếng.
- Chuẩn bị túi chứa tip micropipette sau khi dùng.
- Lấy nguyín liệu từ ngăn đm 20oC của tủ lạnh để văo ngăn +4oC để rê đông. Vẫn giữ Enzyme Mix ở ngăn đm 20o
C.
- Trộn đều nguyín liệu bằng Votex vă ly tđm bằng Quick spin để kĩo nguyín liệu xuống đây tube.
- Câc nguyín liệu đê rê đông ở +4oC phải giữ lạnh bằng “cool box” khi mang văo PCR Cabinet để chuẩn bị Master Mix. Nước không có RNA không cần phải giữ lạnh.
- Căn cứ văo “Tổng thể tích Master Mix cho N phản ứng” để chọn tube chứa Master Mix cho phù hợp.
- Lấy câc loại nguyín liệu theo thứ tự (cột Stt) trong phiếu cho văo tube chứa Master Mix, do Enzyme Mix không đông đâ ở đm 20o
C nín vẫn giữ ở ngăn đm 20oC đến khi sử dụng. Thể tích của từng loại nguyín liệu theo cột “Thể tích cho N phản ứng (µl)”.
Chuẩn bị Master Mix bằng kit Invitrogen
Stt Nguyín liệu Dung dịch
mẹ Thể tích cho 1 phản ứng (µl) Thể tích cho N phản ứng (µl)
1 Nước không có RNA vă DNA 5,5
2 Dung dịch đệm 2X 12,5
3 Taq Mix 0,5
4 Mồi xuôi FMDV_Callahan 3DF 20 µM 0,5 5 Mồi ngược FMDV_Callahan 3DR 20 µM 0,5 6 Đoạn dò FMDV_Callahan 3DP 6 µM 0,5 7 MồixuôiFMDV_SA-IR-219-246F 20 µM 1 8 Mồi ngược FMDV_SA-IR-315-293R 20 µM 1 9 Đoạn dò FMDV_SAmulti2-P-IR-
292-269R 6 µM 0,5
Tổng thể tích Master mix cho 1 phản ứng 20
10 Mẫu RNA 5
Tổng thể tích cho 1 phản ứng 25
- Để câc tube nguyín liệu (dung dịch mẹ) trở lại ngăn đm 20oC của tủ lạnh, đúng vị trí quy định.
- Trộn đều Master Mix bằng votex vă ly tđm bằng Quick spin để kĩo toăn bộ Master Mix xuống đây tube trước khi chia văo đĩa PCR 96 giếng (20 µl/giếng).
- Đĩa PCR 96 giếng đê chứa Master Mix phải giữ lạnh bằng “cool box” vă chuyển sang Phòng Chiết tâch RNA để văo ngăn +4oC của tủ lạnh, sẵn săng để xĩt nghiệm.
* Câc bước tiến hănh
Quy trình chiết tâch RNA
*Chuẩn bị dung dịch hóa chất:
- Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thím Proteinase Kvă Carrier RNA văo dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhă sản xuất InviMAG Virus RNA Kit. Đânh dấu văo mục đê bổ sung Proteinase K vă Carrier RNA trín nhên dân của lọ vă được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 - 25o
C).
- Chuẩn bị hỗn hợp hạt từ (Bead Mix): Cho MAP Solution A văo dung dịch Binding Solution theo hướng dẫn của nhă sản xuất InviMAG Virus RNA Kit.
- Dung dịch rửa 1 (Wash Solution 1): Cho thím Ethanol 100% văo dung dịch rửa 1 đậm đặc theo hướng dẫn của nhă sản xuất InviMAG Virus RNA Kit. Đânh dấu văo mục đê bổ sung Ethanol trín nhên dân của lọ vă được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15-25oC).
- Dung dịch rửa 2 (Wash Solution 2): Cho thím Ethanol 100% văo dung dịch rửa 2 đậm đặc theo hướng dẫn của nhă sản xuất InviMAG Virus RNA Kit. Đânh dấu văo mục đê bổ sung Ethanol trín nhên dân của lọ vă được bảo quản ở nhiệt độ phòng (15- 25o
C).
- Dung dịch Elution Buffer (EB): Dung dịch thu hồi RNA sau khi chiết tâch, được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kit.
Tất cả câc dung dịch chiết tâch bao gồm: Lysis Buffer RV, hạt từ tính (Bead Mix), dung dịch rửa 1, dung dịch rửa 2 vă dung dịch Elution Buffer (EB) sau khi chuẩn bị xong đều được chia nhỏ văo câc tube nhựa vô trùng với thể tích cần dùng đê được tính trước, dân nhên, ghi ngăy sử dụng vă bảo quản ở nhiệt độ phòng (15- 25oC), riíng hỗn hợp hạt bảo quản ở 4o
C.
Chiết tâch RNA sử dụng mây Thermo Scientific KingFisher 96 (chiết xuất 96 mẫu): hút câc dung dịch chiết tâch bao gồm dung dịch rửa 1, dung dịch rửa 2 vă dung dịch Elution Buffer văo từng giếng của đĩa theo sơ đồ chiết tâch đê chuẩn bị trước với lượng như sau: đĩa Washing Wash 1: 800µl dung dịch nước rửa 1/giếng, đĩa Washing Wash 2 vă Washing Wash 3: 800µl dung dịch nước rửa 2/giếng, đĩa Elution Buffer: 100µl dung dịch EB/giếng. Trín mỗi đĩa đều phải dân nhên vă ghi ngăy sử dụng.
Sau quâ trình chuẩn bị, chuyển câc dung dịch chiết tâch sang phòng chiết tâch RNA. Dung dịch đệm Lysis Buffer RV chuyển sang phòng huyết thanh.
*Quy trình chiết xuất:
Dùng Micropippette hút 540µl dung dịch đệm Lysis cho văo một ống Eppendorf 1,5ml vô trùng có ghi sẵn kí hiệu mẫu theo phiếu quản lý RNA.
Rê đông, vortex huyễn dịch 10% đê chuẩn bị. Sau đó tiến hănh ly tđm lạnh 2.500×g trong 15 phút. Lấy 200µl huyễn dịch mẫu 10% văo câc ống Eppendorf đê chuẩn bị vă vortex 1 phút.
Spin để kĩo câc phần bâm trín nắp ống Eppendorf xuống, sau đó xếp câc ống Eppendorf theo thứ tự trín khay inox.
Sử dụng micropipette 1000µl rút toăn bộ dung dịch trong ống Eppendorf cho văo câc giếng của đĩa chiết tâch 96 giếng theo sơ đồ bố trí mẫu. Lấy giấy dân đĩa dân mặt đĩa.
Đặt đĩa lín mây lắc nhiệt HLC, lắc với vận tốc 750 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 65oC. Cần căi đặt vă khởi động mây trước khi đặt đĩa văo.
Lấy đĩa ra khỏi mây lắc, để nguội trong 5 phút sau đó thâo giấy dân đĩa ra khỏi đĩa vă cho 280µl hỗn hợp hạt từ đê chuẩn bị cho văo mỗi giếng.
Chú ý: Dùng multipipette để lấy hỗn hợp hạt từ vă phải trộn đều hạt từ trước mỗi lần lấy.
Đặt câc đĩa dung dịch nước rửa vă đĩa mẫu văo mây chiết xuất RNA tự động. Vận hănh mây chiết tâch RNA theo hướng dẫn của nhă sản xuất.
Sau 34 phút quâ trình chiết tâch RNA đê hoăn tất. Lấy tất cả câc đĩa ra khỏi mây, đĩa Elution Plate được giữ lại vă đặt văo Cabinet Class II.
Dùng Micropipette (dùng một lần, mỗi tip cho một giếng) rút toăn bộ dung dịch trong câc giếng cho văo ống Eppendorf 500µl vô trùng đê ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết xuất tương ứng với mỗi giếng theo sơ đồ bố trí mẫu trín phiếu quản lý RNA.
Bảo quản mẫu DNA thu được ở -2oC trong vòng 02 ngăy hoặc -7oC khi cần bảo quản lđu hơn.
Thực hiện phản ứng, vận hănh mây RT-PCR
Dùng Micropipette thể tích 0,5-10 µl rút 5µl mẫu đê chiết tâch trín cho văo đĩa PCR 96 giếng đê chứa sẵn 20µl dung dịch Master Mix đê được chuẩn bị.
Với đĩa PCR 96 giếng: dùng giấy dân đĩa chuyín dụng dân thật kín bề mặt đĩa. Sau đó ly tđm lạnh 2000 vòng/1 phútđể kĩo toăn bộ dung dịch phản ứng xuống đây giếng.
Đặt đĩa PCR 96 giếng văo mây Realtime PCR theo sơ đồ bố trí thí nghiệm. Căi đặt chương trình nhiệt đê chuẩn bị trín phiếu quản lý xĩt nghiệm PCR. Đặc biệt, nhập dữ liệu mẫu phải phù hợp với sơ đồ bố trí mẫu trín mây để kết quả phản ânh đúng phản ứng của mẫu tương ứng.
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm
SƠ ĐỒ BỐ TRÍ VĂ KẾT QUẢ (Ct) MẪU XĨT NGHIỆM TRÍN MÂY Realtime PCR/ Realtime RT-PCR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H
Chương trình nhiệt độ vă thời gian được căi đặt như sau
50oC 15 phút 1 chu kỳ
95oC 02 phút 1 chu kỳ
94oC 20 giđy
40 chu kỳ
60oC 60 giđy
Ghi nhận tín hiệu ở bước 60o
* Phiếu quản lý xĩt nghiệm PCR
Đường nền mặc định: Đối chứng sử
dụng: Lô:
Kết quả (Ct):
Đường nền chỉnh sửa: Kết quả (Ct):
Hăng A Ký hiệu ống R/DNA Ký hiệu ống PCR Kết quả Ct Ct Hăng B Ký hiệu ống R/DNA Ký hiệu ống PCR Kết quả Ct Ct 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12
* Đânh giâ kết quả
Đọc kết quả
- Kiểm tra hệ thống mẫu đối chứng dương vă đối chứng đm.
- Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương vă đối chứng đm lă đúng thì điều chỉnh đường chuẩn nền (baseline) theo 5% tín hiệu huỳnh quang theo mỗi lần của mây hiển thị vă đọc câc kết quả xĩt nghiệm dựa theo baseline năy.
- Nếu hệ thống mẫu đối chứng dương vă đối chứng đm lă không đúng thì phải thực hiện lại phĩp thử.
Giải thích kết quả
Mẫu dương tính khi giâ trị Ct <35.
Mẫu đm tính khi không thấy có giâ trị Ct trong 40 chu kỳ phản ứng (Ct vô cực), mẫu có giâ trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi lă nghi ngờ.
Phản ứng có giâ trị khi:Mẫu đối chứng dương thì dương tính, mẫu đối
chứng đm biểu hiện đm tính.