Kỹ thuật PCR được Kary Mullis vă cộng sự phât minh ra văo năm 1985. Đđy lă phương phâp tạo dòng in vitro cho phĩp khuếch đại một vùng ADN (deoxyribonucleic) đặc hiệu trín hệ gen. Phản ứng PCR chỉ có khả năng khuếch đại ADN do đó với những trường hợp mă thông tin di truyền lă ARN như virus LMLM thì cần có một quâ trình chuyển từ ARN thănh ADN trước khi thực hiện phản ứng PCR, đó lă phản ứng sao chĩp ngược (Reverse Transciption – RT) [32]. Do đó, có thể sử dụng phản ứng PCR để lăm tăng số lượng câc đoạn ADN đặc hiệu virus
LMLM có trong bệnh phẩm cần chẩn đoân dựa văo việc xâc nhận đoạn DNA sản phẩm PCR ứng với độ dăi của đoạn ADN đặc hiệu virus LMLM kẹp bởi cặp mồi PCR trín trình tự axít nucleic đê đăng ký trong ngđn hăng dữ liệu gen.
Nguyín lý vă ứng dụng PCR (phản ứng chuỗi polymeraza) khâ đơn giản. PCR (polymerase chain reaction) lă kỹ thuật dựa trín phản ứng tổng hợp ADN nhờ enzym DNA-polymeraza lặp đi lặp lại mă chỉ một đoạn nhất định của ADN đặc hiệu trong bệnh phẩm được tăng lượng. DNA-polymeraza (DNA- polymerase) lă enzyme lấy ADN một sợi lăm khuôn để tổng hợp sợi ADN tương bổ [32].
Quâ trình tổng hợp ADN được thực hiện nối dăi một hướng từ đầu 5' đến đầu 3' vă tại vị trí xuất phât của quâ trình tổng hợp phải có mặt một đoạn ngắn ADN một sợi gọi lă mồi (primer) tương bổ với ADN khuôn. Nếu tổng hợp được hai mồi (một cặp) tương bổ với hai vị trí trín hai sợi khâc nhau của một ADN hai sợi vă hướng của phản ứng từ một mồi ngược với hướng phản ứng từ mồi kia, tức lă kẹp một đoạn cần tăng lượng của ADN, thì nếu cho cặp primer với lượng gấp bội văo dịch chứa bệnh phẩm thì phản ứng DNA polymeraza sẽ thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần [32]. Kết quả lă từ vị trí một mồi ADN được kĩo dăi rồi trong chu kỳ tiếp theo lại lăm khuôn cho mồi có chiều ngược lại tổng hợp kĩo dăi ADN đến quâ vị trí của mồi trước [33].
Quâ trình tổng hợp lặp đi lặp với một cặp mồi lăm cho chỉ đoạn ADN nằm giữa (tức được kẹp giữa) hai mồi được tăng lượng theo cấp số nhđn. Nếu số chu kỳ nhiệt lă 30 thì đoạn ADN năy tăng lă 230 (tức khoảng 109 ) lần [32]. Để thực hiện phản ứng cần có DNA-polymeraza chịu nhiệt vă thiết bị luđn nhiệt tự động hóa vă mỗi chu kỳ phản ứng phải qua ba bước: Bước 1: biến tính ADN hai sợi thănh một sợi bằng nhiệt (94 - 95°C). Bước 2: nhiệt độ thích hợp để mồi gắn văo trình tự nucleotid đặc hiệu của ADN bệnh phẩm vă bước 3: nhiệt độ thích hợp phản ứng kĩo dăi chuỗi ADN nhờ DNA-polymeraza. Nhiệt độ chu kỳ ở bước 2 vă 3 phụ thuộc văo thănh phần nucleotid của mồi vă khuôn nhưng có thể vận dụng nhiệt độ gắn mồi khoảng 60°C, nhiệt độ phản ứng kĩo dăi khoảng 70°C [32].
Phương phâp RT-PCR được âp dụng rộng rêi trong chẩn đoân xâc định sự có mặt của RNA virus LMLM trong bệnh phẩm. So sânh kỹ thuật chẩn đoân bệnh LMLM tại WRL cho biết dương tính RT-PCR có 70 - 80% mẫu bệnh phẩm có kết quả dương tính bằng kỹ thuật LPBE [57] vă 20 - 30% mẫu dương tính sau khi nuôi cấy trín tế băo. Để phât hiện trđu bò nhiễm bệnh, đồng thời xâc định type virus gđy bệnh LMLM dai dẳng ở thực địa, kỹ thuật RT-PCR tỏ ra rất nhạy, nhanh, chính xâc, hiệu quả thường được sử dụng bổ sung hoặc thay thế cho phương phâp huyết thanh học [74].
Chương 2. MỤC TIÍU, NỘI DUNG VĂ PHƯƠNG PHÂP NGHIÍN CỨU