1.5.3.1. Phản ứng trung hoă virus
Phản ứng năy dùng chẩn đoân câc trường hợp bị bệnh nhẹ, không điển hình, phải lấy mâu chắt huyết thanh để tìm khâng thể. Phản ứng năy rất đặc hiệu, nhạy vă nhanh chóng. Việc tìm ra khâng thể đặc hiệu ở trđu bò chưa được tiím phòng vaccine LMLM đủ cơ sở để kết luận lă con vật có bệnh. Nhưng nếu sau tiím
vaccine thì kết quả khó giải thích. Khâng nguyín lă virus LMLM chuẩn nuôi cấy trín môi trường IB-RS-2, BHK-21, tế băo thận lợn hoặc thận cừu vă gđy bệnh tích tế băo. Khâng thể nghi lă huyết thanh của trđu bò nghi mắc bệnh được xử lý ở nhiệt độ 56ºC trong 30 phút. Phản ứng trung hoă virus thực hiện trín môi trường tế băo IB-RS-2, BHK-21, tế băo thận lợn hoặc thận cừu được nuôi trong câc đĩa nhựa lỗ nhỏ đây bằng. Để xâc định type gđy bệnh, cho huyết thanh của trđu bò nghi mắc bệnh văo 7 ống nghiệm, sau đó cho văo mỗi ống nghiệm từng type virus LMLM đê biết với hiệu giâ virus đê được xâc định lă 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương đương với huyết thanh nghi, rồi cho văo tủ ấm 37oC trong khoảng 1 giờ để khâng nguyín vă khâng thể tâc động với nhau. Sau đó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy văo câc dêy lỗ nhựa đê nuôi cấy tế băo, đồng thời câc lỗ đối chứng đm không cấy hỗn dịch mă để tế băo tiếp tục phât triển vă câc lỗ đối chứng dương cấy câc type virus LMLM tiếp tục để tủ ấm 37o
C trong vòng 2 - 3 ngăy. Kết quả cho thấy, nếu lỗ đĩa nhựa năo không có hiện tượng huỷ hoại tế băo, giống với lỗ đối chứng đm, chứng tỏ lỗ đó có khâng thể tương đương với typevirus LMLM nín virus bị khâng thể trung hoă vă không còn khả năng huỷ hoại tế băo. Ngược lại, nếu lỗ đĩa năo có hiện tượng huỷ hoại tế băo, tức lă ở đó virus vẫn còn khả năng gđy bệnh, giống lỗ đối chứng dương, chứng tỏ khâng thể không tương ứng với type virus đó hoặc trong huyết thanh không có khâng thể. Sau khi đê định type virus gđy bệnh, người ta pha loêng huyết thanh nghi theo cơ số 2, tức ở câc nồng độ 1/2, 1/4, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128… Lấy từng độ pha loêng huyết thanh năy trộn với type virus đê biết một lượng tương đương, để tủ ấm 37o
C trong 1 giờ. Sau đó lấy hỗn dịch của từng độ pha loêng cho văo câc dêy lỗ đĩa nhựa đê nuôi cấy tế băo, cần có câc lỗ đối chứng đm vă dương để so sânh, để tủ ấm 37o
C trong 2 -3 ngăy vă đem ra đọc kết quả hiệu giâ khâng thể tương ứng với độ pha loêng lớn nhất mă ở đó tế băo nuôi không bị huỷ hoại [20]; [22].
1.5.3.2. Phản ứng kết hợp bổ thể (Complement Fixation Test – CFT)
Phản ứng kết hợp bổ thể hay còn gọi lă cố định bổ thể lă phản ứng huyết thanh học phât hiện tổ hợp khâng nguyín - khâng thể thông qua vận dụng thuộc tính gđy dung giải tế băo, kể cả tế băo hồng cầu, của hệ thống bổ thể, một khi hệ thống năy được hoạt hóa nhờ khâng thể khi khâng thể hình thănh tổ hợp khâng nguyín - khâng thể [33].
Phản ứng kết hợp bổ thể lă phản ứng thông thường được dùng để phât hiện bệnh LMLM, vì đơn giản, cho kết quả nhanh, chính xâc vă ít tốn kĩm. Nguyín lý: Dùng câc serotype huyết thanh đê biết để phât hiện typevirus gđy bệnh [24]. Phản
ứng kết hợp bổ thể được thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống phản ứng chính vă hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ hay hệ thống dung huyết) [33].
Huyết thanh miễn dịch (huyết thanh chuẩn) của từng serotype được chế trín chuột lang bằng phương phâp gđy tối miễn dịch. Khâng nguyín nghi lă mâu trđu bò nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy văo môi trường phù hợp, sau đó lấy dịch để lăm phản ứng. Phản ứng kết hợp bổ thể cũng đê được sử dụng để chẩn đoân phđn biệt giữa virus LMLM vă câc virus gđy viím miệng mụn nước khâc [72].
1.5.3.3. Phản ứng ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Theo Tô Long Thănh (2000), ELISA lă một phản ứng dùng để chẩn đoân nhanh bệnh LMLM vă để giâm định type huyết thanh của virus. Phản ứng năy có những thuận lợi hơn hẳn câc phản ứng thông thường khâc. Đđy lă một phản ứng có độ đặc hiệu cao khi dùng với một khâng thể đơn dòng, phản ứng cũng có độ nhạy cao trong chẩn đoân vă định type virus [61]; [60]. Phản ứng ELISA cũng thường được sử dụng hơn so với phản ứng kết hợp bổ thể vì nó có độ đặc hiệu vă độ nhạy cao hơn, không bị ảnh hưởng của câc yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể [23]. Nguyín lý của phương phâp lă dùng khâng khâng thể chống khâng nguyín virus đê gắn enzyme (ELISA trực tiếp) hoặc khâng thể chống khâng thể của động vật loăi khâc (ELISA giân tiếp) rồi cho kết hợp trực tiếp hoặc giân tiếp (qua khâng thể động vật loăi thứ hai đặc hiệu khâng nguyín virus) với khâng nguyín đê hấp phụ trín giâ thể rắn, như trong đây vă thănh lỗ (giếng) của khay nhựa, rửa để loại bỏ yếu tố không kết hợp, sau đó cho cơ chất văo, cơ chất bị enzyme phđn huỷ tạo mău vă khi so mău trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ phản ứng [22].
Phản ứng ELISA trực tiếp dùng để phât hiện khâng nguyín
Cố định khâng thể đặc hiệu lín phiến chất dẻo, rửa nước để loại bỏ khâng thể không gắn. Sau đó cho huyễn dịch bệnh phẩm đê chiết xuất hoă tan (khâng nguyín) lín, nếu có khâng nguyín tương ứng, chúng sẽ gắn với khâng thể đặc hiệu, rửa nước để loại bỏ khâng thể thừa. Tiếp theo cho khâng thể đê gắn enzyme văo, nếu ở bước thứ hai đê có sự kết hợp khâng nguyín - khâng thể đặc hiệu thì ở bước thứ ba năy sẽ xảy ra kết hợp lần thứ hai của khâng nguyín với khâng thể đânh dấu enzyme, rửa nước loại bỏ khâng thể đânh dấu thừa. Cuối cùng cho cơ chất tương ứng với enzyme văo.Nếu có mău tức lă có khâng nguyín tương ứng, kết luận phản ứng dương tính. Ngược lại nếu không có mău tức lă khâng nguyín không tương ứng, cho nín khâng nguyín bị rửa trôi từ bước thứ hai, do đó không có sự kết hợp: khâng thể-khâng nguyín-khâng khâng thể, kết luận phản ứng đm tính [32]; [20]; [22].
Phản ứng ELISA giân tiếp dùng để phât hiện khâng thể
Gắn khâng nguyín đê biết lín phiến chất dẻo, rửa nước để loại bỏ khâng nguyín thừa. Sau đó đưa huyết thanh cần chẩn đoân lín, nếu có khâng thể tương ứng với khâng nguyín chuẩn thì sẽ có kết hợp khâng nguyín-khâng thể, rửa nước loại bỏ khâng thể thừa. Tiếp tục cho khâng khâng thể tương ứng đê gắn enzyme văo, nếu đê có kết hợp khâng nguyín-khâng thể ở bước 2 thì sẽ tiếp tục có kết hợp khâng nguyín-khâng thể-khâng khâng thể gắn enzyme vă khi rửa nước không bị trôi. Cuối cùng cho cơ chất tương ứng với enzyme văo [20]; [22].
Đânh giâ kết quả:Nếu enzyme phđn huỷ cơ chất tạo mău lă phản ứng dương tính, huyết thanh nghi có khâng thể tương ứng.Trong trường hợp huyết thanh không có khâng thể tương ứng với khâng nguyín, sẽ không có kết hợp khâng nguyín - khâng thể ở bước 2, khi cho khâng khâng thể văo sẽ không có kết hợp khâng nguyín - khâng thể-khâng khâng thể, khi rửa nước khâng khâng thể (gắn enzyme) bị trôi vă cho cơ chất văo thì không có enzyme phđn huỷ, nín không có mău, phản ứng đm tính [20]; [22].
Hiện nay, trong xĩt nghiệm chẩn đoân thường sử dụng phản ứng 3ABC- ELISA để chẩn đoân phđn biệt huyết thanh dương tính lă do nhiễm virus thực địa hay do vaccine. Cơ sở khoa học của phương phâp năy lă khi virus LMLM nhiễm văo cơ thể trđu bò móng guốc chẵn, quâ trình nhđn lín của virus sẽ diễn ra. Trong quâ trình năy, virus vừa tạo ra câc thănh phần để tâi tạo câc hạt virus mới (câc virion), vừa tạo ra câc thănh phần không tham gia tạo thănh câc hạt virion mới mă chỉ đóng vai trò lă câc enzyme giúp cho quâ trình nhđn lín của virus. Câc thănh phần kết hợp thănh bản thđn virus có tính khâng nguyín gọi lă proten Cấu trúc (structure protein). Câc thănh phần không tham gia kết hợp thănh virion mới vă có tính khâng nguyín gọi lă protein không cấu trúc (non-structure protein) [52]; [53].
Trong câc protein không cấu trúc của virus LMLM thì khâng nguyín 3ABC có tính khâng nguyín rất cao, nó kích thích cơ thể trđu bò tạo ra khâng thể đặc hiệu với số lượng lớn vă tồn tại nhiều thâng trong huyết thanh trđu bò bị nhiễm. Do đó, việc phât hiện khâng thể đặc hiệu 3ABC cho phĩp kết luận trđu bò đê bị nhiễm virus LMLM [28].
Tuy nhiín, trong câc loại vaccine vô hoạt LMLM của câc hêng Intervet (Hă Lan) vă Merial (Phâp) những khâng nguyín không cấu trúc đê được loại bỏ (gọi lă vaccine tinh khiết). Sau khi tiím cho trđu bò chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra khâng thể chống lại khâng nguyín cấu trúc (hạt virus) chứ không có khâng thể chống lại khâng nguyín không cấu trúc 3ABC. Một số loại vaccine khâc (ví dụ: vaccine đơn
type O vă hai type O-Asia1 của Trung Quốc) lă vaccine không tinh khiết, do đó, dùng phản ứng 3ABC-ELISA sẽ không xâc định chắc chắn trđu bò nhiễm virus LMLM thực địa hay do tiím vaccine không tinh khiết. Việc kết luận trđu bò mắc bệnh hay do tiím vaccine Trung Quốc phải kết hợp với xĩt nghiệm bằng phản ứng trung hòa virus vă điều tra lịch sử tiím phòng vaccine [38].
3ABC-ELISA lă kỹ thuật dùng để xâc định trường hợp dương tính huyết thanh học ở chẩn đoân phât hiện khâng thể lă do khâng thể do nhiễm virus thực địa vă do tiím phòng. Kỹ thuật năy dựa văo cơ sở khoa học như sau: Virus LMLM khi xđm nhiễm văo tế băo vật chủ sẽ dịch mê để tạo ra câc protein cấu trúc vă câc protein không cấu trúc. Câc protein không cấu trúc liín quan đến hoạt động của virus vă biến đổi chức năng tế băo vật chủ, tuy nhiín vẫn kích thích tạo ra câc khâng thể đặc hiệu. Vaccine chỉ chứa hạt virus tinh sạch với dung dịch đệm vă chất bổ trợ, loại bỏ protein phi cấu trúc nín đâp ứng miễn dịch do vaccine chỉ tạo ra khâng thể khâng protein cấu trúc của virus. Trong trường hợp vaccine không tinh sạch bị nhiễm protein phi cấu trúc, cũng chỉ xảy ra một đâp ứng miễn dịch yếu vă ngắn ngủi đối với protein năy vì hăm lượng của chúng rất thấp. Do đó, nếu phât hiện câc khâng thể khâng protein không cấu trúc, ta có thể kết luận con vật bị nhiễm virus LMLM chứ không phải do tiím vaccine [52]; [53].
Câc protein phi cấu trúc của virus LMLM gđy đâp ứng miễn dịch lă 3D, 3A/3AB/3ABC, 2C, 2B, 3C vă Lpro. Gần đđy, một số protein phi cấu trúc 2C, 3B, 3AB vă 3ABC đê được nghiín cứu để phât triển câc phương phâp phât hiện có độ nhạy cao. Một trong những phương phâp năy lă Enzyme-linked immuno-electro- transfer blot (EITB) [49]; [50]. Đđy lă phản ứng có độ đặc hiệu vă độ nhạy cao để nhận diện khâng huyết thanh dương tính vă đm tính [52].
Câc phương phâp ELISA được chọn do có ưu điểm về độ nhạy cao, dễ sử dụng, thao tâc nhanh phù hợp với số lượng lớn mẫu ở thực địa [50]; [70].