G0 (mmol/L) – 3,5 Chỉ số HOMA-β bình thường: >116.65%[140]
G0: nồng độ insulin máu lúc đói I0: nồng độ insulin máu lúc đói
Chỉ số Mc Auley
Mc auley index= e (2,63-0,28 ln (I0)–0,31 ln (TAG0) TAG0 nồng độ triglyceride lúc đói
I0: nồng độ insulin máu lúc đói
Bình thường Mc Auley index <5,8[39] + Chỉ số TyG tính theo công thức:
Ln (TG [mg/dL] × glucose [mg/dL] TyG index= 2
Kháng insulin khi TyG>4,65 [40]
* Định lượng HbA1c máu lúc đói:
Sử dụng phương pháp trao đổi ion bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC) kết hợp với tách rửa theo mức gradient để tách các phân nhóm hemoglobin và các biến thể (HbC, HbS, HbD) từ lượng huyết cầu có trong máu toàn phần ở người.
Xét nghiệm bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, được tiến hành trên máy DS360 (Hoa Kỳ).
- Đơn vị đo: %.
- Giá trị bình thường HbA1c: 4,4 – 6,4%.
2.2.4.5. Định lượng nồng độ resistin
* Nguyên lý:
Nguyên lý: Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể kiểu sandwich. Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể được gắn ở đáy giếng ELISA với kháng nguyên resistin có trong huyết thanh bệnh nhân kết hợp với sự chuyển màu cơ chất đặc hiệu trong phản ứng ELISA. Sử dụng bộ kít xét nghiệm của hãng Sigma - Aldrich nay thuộc về Merck (Hoa Kỳ).
- Kit resistin theo phương pháp enzyme miễn dịch là phương pháp định lượng in vitro để phát hiện peptid resistin dựa trên nguyên lý thử nghiệm cạnh tranh enzyme miễn dịch. Các microplate của Kit được phủ bằng kháng thể kháng huyết thanh thỏ. Sau bước chặn và phủ giếng bằng kháng thể kháng resistin, cả peptid resistin và peptid
chuẩn trong mẫu được biotinyl hóa tương tác thay thế bằng kháng nguyên resistin. Resistin biotinyl hóa không bị thay thế sẽ phản ứng với Streptavidin - horseradish peroxidase (SA-HRP), chất này xúc tác phản ứng tạo màu. Cường độ tín hiệu tạo màu trực tiếp theo tỷ lệ lượng phức hợp biotinylated peptideSA-HRP và tỷ lệ nghịch với lượng resistin trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Do sự gắn cạnh tranh với kháng nguyên Resistin giữa biotinylated Resistin peptide và các peptid trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Đường cong chuẩn của dung dịch mẫu đã biết nồng độ resistin được xác định và nồng độ Resistin trong mẫu thử sẽ được tính toán dựa theo đường cong chuẩn.
- Nơi tiến hành: Phòng Thí nghiệm Sinh lý bệnh phân tử; Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y.
- Đơn vị tính: ng/ml.
* Các bước tiến hành:
Theo các bước tiến hành theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất; đọc nồng độ trên máy ELISA DAR 800 của hãng Diagnostic Automation (Mỹ):
- Lấy máu tĩnh mạch lúc đói; cùng thời gian lấy máu để định lượng insulin máu và glucose máu, tách và bảo quản mẫu theo hướng dẫn của Labo và hãng.
- Pha loãng dung dịch chuẩn resistin theo hướng dẫn của nhà sản xuất:
+ Chuẩn bị 8 ống nhựa eppendorf vô khuẩn 1,5 ml
+ Ống 1: Thêm 496 l với 4 l dung dịch chuẩn được dung dịch có nồng độ chuẩn là 400 pg/ml.
+ Các ống 2, 3, 4, 5, 6, 7 mỗi ống cho vào 200 l dung dịch pha mẫu. Sau đó tiếp tục pha loãng bằng cách hút 200 l dung dịch từ ống 1 sang ống 2 trộn đều, hút 200 l dung dịch từ ống 2 sang ống 3 cứ tiếp tục như vậy cho đến ống 7. Ống số 8 là dung dịch pha loãng mẫu. Như vậy sau quá trình pha loãng ta thu được các ống với nồng dộ lần lượt là: 400 pg/ml, 160 pg/ml, 64 pg/m, 25,6 pg/ml, 10,24 pg/ml, 4,1 pg/ml, 1,64 pg/ml và 0 pg/ml.
- Chuẩn bị mẫu và chuẩn: đặt về nhiệt độ phòng (18 – 250C): mẫu bệnh phẩm được
- Pha 100 l chuẩn và mẫu vào từng giếng tương ứng; ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 2,5 giờ hoặc ủ qua đêm ở 40C có lắc nhẹ.
- Rửa 4 lần với dung dịch rửa 1x, thấm khô các giếng.
- Thêm 100 l kháng thể gắn biotin vào mỗi giếng, ủ trong vòng 1 tiếng có lắc nhẹ nhàng.
- Lặp lại quy trình rửa như trước.
- Thêm 100 l cơ chất TMB vào mỗi giếng, ủ trong 30 phút với điều kiện phòng tối.
- Thêm 50 l dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng, Đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.
- Tính toán kết quả: dựa vào đường cong chuẩn đo được của các giếng chuẩn với nồng độ đã biết trước.
50 l 50 l 50 l 50 l
1000 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/m 1 ng/mL 100 pg/mL 0 pg/mL
Hình 2.1. Quy trình pha loãng dung dịch chuẩn resistin
Hình 2.2. Nguyên lý xét nghiệm và các bước định lượng resistin máu bằng phương
pháp ELISA
* Nguồn: theo Sigma – Aldrich (2015) [141]
* Phân tích kết quả:
Kết quả được tính trung bình của mỗi bộ sao chuẩn, mẫu và chứng trừ đi khoảng trống quang học. Đồ thị đường cong chuẩn dùng phần mềm SigmaPlot software (hoặc phần mềm khác có khả năng phân tích 4 thông số hồi quy logistic) với nồng độ chuẩn trên trục x và tỷ lệ % hấp thụ trên trục y (xem cách tính ở dưới). Vẽ đường cong phù hợp nhất qua điểm chuẩn. Phần trăm hấp thụ = (B- khoảng trống OD)/ (Bo-khoảng trống OD) B = OD của mẫu thử hoặc Bo chuẩn =OD của chuẩn zero (gắn hoàn toàn). Đường cong dữ liệu điển hình là để trình diễn. Đường cong chuẩn cần được xác định cho từng phép thử.
Hình 2.3. Phân tích kết quả nồng độ resistin EIA Peptide[141]
Sau đó quy đổi thành đơn vị ng/ml.
Hiện nay chưa có chỉ số tham chiếu về nồng độ resistin.
Kết quả xét nghiệm ở bệnh nhân được xác định là: Bình thường khi nồng độ resistin nằm trong khoảng > tứ phân vị dưới và nhỏ hơn tứ phân vị trên của nhóm chứng.
- Tăng khi nồng độ resistin lớn hơn phân vị trên của nhóm chứng. - Giảm khi nồng độ resistin nhỏ hơn phân vị dưới của nhóm chứng.
2.2.4.6. Định lượng nồng độ visfatin
Nguyên lý
- Nguyên lý: Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể kiểu sandwich.
- Dựa trên phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể được gắn ở đáy giếng ELISA với kháng nguyên visfatin có trong huyết thanh bệnh nhân kết hợp với sự chuyển màu cơ chất đặc hiệu trong phản ứng ELISA. Sử dụng bộ kít xét nghiệm của hãng Sigma - Aldrich nay thuộc về Merck (Hoa Kỳ).
- Kit visfatin theo phương pháp enzyme miễn dịch là phương pháp định lượng in vitro để phát hiện peptid visfatin dựa trên nguyên lý thử nghiệm cạnh tranh enzyme
Dung dịch thử nghiệm A Dung dịch thử nghiệm B
miễn dịch. Các microplate của Kit được phủ bằng kháng thể kháng huyết thanh thỏ. Sau bước chặn và phủ giếng bằng kháng thể kháng visfatin, cả peptid visfatin được biotinyl hóa và peptid chuẩn trong mẫu tương tác thay thế bằng kháng nguyên visfatin. Visfatin biotinyl hóa không bị thay thế sẽ phản ứng với Streptavidin-horseradish peroxidase (SA-HRP), chất này xúc tác phản ứng tạo màu. Cường độ tín hiệu tạo màu trực tiếp theo tỷ lệ lượng phức hợp biotinylated peptide SA-HRP và tỷ lệ nghịch với lượng visfatin trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Do sự gắn cạnh tranh với kháng nguyên visfatin giữa biotinylated visfatin peptide và các peptid trong dung dịch chuẩn hoặc trong mẫu thử. Đường cong chuẩn của dung dịch mẫu đã biết nồng độ visfatin được xác định và nồng độ visfatin trong mẫu thử sẽ được tính toán dựa theo đường cong chuẩn.
* Các bước tiến hành
- Các bước tiến hành pha dịch chuẩn và các bước tiếp theo giống như các bước đã nêu trong phần định lượng resistin.
Hình 2.4. Nguyên lý xét nghiệm và các bước định lượng visfatin máu bằng phương
pháp ELISA[142]
- Nơi tiến hành: Phòng Thí nghiệm Sinh lý bệnh phân tử; Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y.
50 l 50 l 50 l 50 l
1000 ng/mL 100 ng/mL 10 ng/m 1 ng/mL 100 pg/mL 0 pg/mL
Hình 2.5. Pha loãng dung dịch chuẩn visfatin
Mật độ quang học (OD) của các giếng được đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm, giá trị OD của các giếng ELISA tỷ lệ thuận với lượng visfatin có trong mẫu.
* Phân tích kết quả:
Kết quả được tính trung bình của mỗi bộ sao chuẩn, mẫu và chứng trừ đi khoảng trống quang học. Đồ thị đường cong chuẩn dùng phần mềm SigmaPlot software (hoặc phần mềm khác có khả năng phân tích 4 thông số hồi quy logistic) với nồng độ chuẩn trên trục x và tỷ lệ % hấp thụ trên trục y (xem cách tính ở dưới). Vẽ đường cong phù hợp nhất qua điểm chuẩn. Phần trăm hấp thụ = (B- khoảng trống OD)/ (Bo-khoảng trống OD) B=OD của mẫu thử hoặc Bo chuẩn =OD của chuẩn zero (gắn hoàn toàn). Đường cong dữ liệu điển hình là để trình diễn. Đường cong chuẩn cần được xác định cho từng phép thử.
Sau khi loại bỏ các thành phần dư thừa không bám vào thành giếng; sự thay đổi hoạt tính của enzyme trong mỗi giếng tương ứng với sự có mặt của nhiều hay ít của các cytokine được phát hiện bằng cơ chất TMB. Sự đổi màu của cơ chất từ màu xanh sang màu vàng thể hiện sự có mặt của visfatin trong các giếng. Dung dịch hoà loãng mẫu được dùng làm đối chứng.
Đơn vị đo của visfatin: ng/ml