2.2.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn
Tinh dầu đƣợc tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn trình bày ở mục 2.1.1.2, theo phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán, đƣợc qui định tại hƣớng dẫn M44 – A và M02 – A11 của CLSI [23], [30].
2.2.2.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng thử nghiệm
Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là Mueller–Hinton Agar (MHA) và môi trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA bổ sung 5% máu cừu đối với vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae. Sau khi pha và hấp tiệt trùng, môi trƣờng đƣợc cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4mm. Thể tích môi trƣờng khoảng 6.5ml/đĩa đối với đĩa Φ
60mm và để thực hiện trên hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae và Tinh dầu Ống sinh hàn Ống hứng tinh dầu Nƣớc Bếp đun Bình cầu
20ml/đĩa đối với đĩa Φ 90mm với các chủng vi khuẩn thƣờng. Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, nếu chƣa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ 4 – 8°C. Khi sử dụng, nếu đĩa ƣớt, để đĩa trong tủ ấm tối đa 30 phút cho đĩa khô hoàn toàn.
2.2.2.1.2. Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn chuẩn sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch BHA và BHA bổ sung 5% máu cừu đối với chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Chọn 3-5 khóm vi khuẩn giống nhau tách rời, dùng vòng cấy vô trùng lấy các khóm cho vào ống chứa dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85% có thêm 0,05% Tween 80 và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bƣớc sóng 625nm. Giá trị này tƣơng đƣơng với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml. Vi khuẩn sau khi pha xong phải sử dụng trong vòng 30 phút.
2.2.2.1.3. Chuẩn bị chất thử
Tinh dầu đƣợc tẩm lên các đĩa giấy đƣờng kính 6mm với lƣợng là 3l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 60mm, 7l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 90mm.
2.2.2.1.4. Tiến hành khảo sát
Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng que bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn. Trải vi khuẩn lên môi trƣờng thử nghiệm bằng que bông. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải theo đƣờng zic-zac sát nhau đến giữa đĩa petri, sau đó xoay mặt thạch 600 rồi tiếp tục trải zic-zac nhƣ lần trên, rồi xoay tiếp 600 và trải các đƣờng sát nhau nhƣ vậy đến khi huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải đều trên toàn bộ mặt thạch. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn đƣợc trải đều.
Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu lên bề mặt môi trƣờng bằng kẹp vô trùng. Sau khi đặt đĩa dùng kẹp nhấn nhẹ đĩa xuống mặt thạch để đảm bảo đĩa tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa giấy, phải ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 35 – 37°C trong 24 giờ. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng tròn ức chế đồng nhất. Đo và ghi nhận đƣờng kính vòng ức chế kể cả đƣờng kính của đĩa tẩm tinh dầu bằng thƣớc kẹp có độ chia nhỏ nhất là 0,01mm.
Khả năng kháng mạnh hay yếu đƣợc đánh giá sơ bộ bằng giá trị đƣờng kính vòng ức chế theo Bảng 2.3 [47].
Bảng 2.3. Mức độ kháng vi sinh vật dựa vào đƣờng kính vòng ức chế Đƣờng kính vòng ức chế vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật
> 14 Mạnh
10 – 14 Vừa
7 – 9 Yếu
6 Không kháng
2.2.2.2. Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC)
Tinh dầu có tác động ức chế sẽ đƣợc thử nghiệm tìm MIC bằng phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn [45], [46]; mỗi thử nghiệm thực hiện lặp lại 6 lần.
2.2.2.2.1. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Tƣơng tự với mục 2.2.2.1.2. Sau đó, huyền dịch trên tiếp tục đƣợc pha loãng 10 lần để đạt mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với 107
CFU/ml.
Vi khuẩn sau khi đƣợc pha chế phải đƣợc sử dụng ngay trong vòng 30 phút. 2.2.2.2.2. Môi trƣờng
Môi trƣờng tốt nhất để thực hiện phƣơng pháp pha loãng môi trƣờng thạch xác định MIC là MHA (Mueller-Hinton Agar). Chất thử nghiệm đƣợc hút chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO 1%. Chuẩn bị sẵn 1 dãy gồm 11 đĩa petri Φ 40mm vô trùng và đánh số từ 1 đến 10 ở đáy đĩa; đĩa số 11 đƣợc ký hiệu là đĩa chứng và không cho chất thử vào. Tiến hành pha loãng trong môi trƣờng thử nghiệm sao cho tạo thành dãy có nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ trƣớc. Đối với hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae, khi tiến hành pha loãng cho thêm vào mỗi ống 5% máu cừu. Khoảng nồng độ cần pha phụ thuộc vào MIC dự đoán của chất thử. Sử dụng máy vortex để đảm bảo trộn đều chất thử trong môi trƣờng. Đổ vào đĩa petri và chờ thạch đông.
2.2.2.2.3. Tiến hành khảo sát
Chấm 1µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt đƣợc mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Các đĩa thạch đƣợc để ngửa để dịch cấy trên các điểm cấy thấm hoàn toàn lên mặt thạch khoảng 10-15 phút. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
2.2.2.2.4. Đọc kết quả
Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại.
2.2.2.3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
2.2.2.3.1. Môi trƣờng
Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là BHA bổ sung 5% máu cừu đối với
S.pyogenes và S.pneumoniae và BHA đối với các chủng vi khuẩn còn lại.
2.2.2.3.2. Tiến hành khảo sát
Trên các đĩa thạch đã thực hiện MIC, chọn các đĩa có nồng độ nhƣ sau: 1 đĩa ngay nồng độ MIC và 2 đĩa có nồng độ gấp 2, gấp 4 lần MIC.
Dùng dao đầu nhọn đã tiệt trùng cắt phần thạch đã chấm vi khuẩn trên các đĩa đƣợc chọn làm MBC. Sau đó cho vào mỗi eppendorf 100µl nƣớc muối sinh lý có thêm 0,05% Tween 80, vortex kỹ. Hút huyền dịch trong eppendorf cho vào đĩa môi trƣờng đã đƣợc hấp tiệt trùng sẵn. Dùng que trải thủy tinh tam giác phân tán đều huyền dịch trên mặt thạch cho đến khi mặt thạch hoàn toàn khô.
Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C, nếu có vi khuẩn thì chúng sẽ mọc thành các khóm trên mặt thạch. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
2.2.2.3.3. Đọc kết quả
Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ. Tính số khóm trung bình trên một hộp thạch ở cùng nồng độ. MBC là nồng độ mà tại đó diệt 99,9% vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có tổng số khóm dƣới 10, nồng độ của đĩa thạch này là MBC của chất thử đối với vi
khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại.