Phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng lỏng
Nguyên tắc: Trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trƣờng lỏng đã pha sẵn chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đƣa vi khuẩn thử nghiệm vào. Đem ủ ở 35 – 37oC trong vòng 16 – 20 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn trong môi trƣờng lỏng (môi trƣờng sẽ trong), ngƣợc lại, nếu có sự tăng trƣởng của vi khuẩn, môi trƣờng sẽ đục. Ƣu điểm: Nhanh gọn, dễ thực hiện.
Nhƣợc điểm: Chỉ áp dụng đƣợc với các chất dễ tan trong nƣớc. Phƣơng pháp pha loãng trong thạch
Nguyên tắc: Pha loãng chất thử vào môi trƣờng thạch đun chảy, đổ vào hộp petri. Chấm huyền dịch vi khuẩn lên mặt thạch, ủ từ 16 – 24 giờ. Nếu có khóm vi khuẩn mọc lên thì chất thử không có tác dụng, nếu vi khuẩn không mọc thì chất thử có tác dụng ức chế. Trƣờng hợp vi khuẩn mọc yếu thì cần lặp lại thử nghiệm, kiểm tra các yếu tố có thể ảnh hƣởng tới kết quả thử nghiệm (chất nhũ hóa, dung môi hòa tan, nhiệt độ môi trƣờng,…).
Ƣu điểm: Có thể sử dụng cho các chất khó tan, không tan trong môi trƣờng.
Nhƣợc điểm: Phƣơng pháp này đòi hỏi kinh nghiệm trong việc chấm vi khuẩn lên bản thạch và phƣơng pháp này đòi hỏi số lƣợng vi khuẩn mỗi lần chấm là nhƣ nhau.
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tƣợng thử nghiệm 2.1.1.1. Dƣợc liệu 2.1.1.1. Dƣợc liệu
Húng quế sử dụng trong nghiên cứu của đề tài đƣợc trồng ở Khánh Hòa. Hai loại húng quế lá lớn và lá nhỏ đƣợc trồng cùng thời điểm và thu hoạch từ lúc cây bắt đầu ra hoa (sau 35 ngày trồng [43]) vào tháng 7/2018. Các cây đƣợc trồng tự nhiên không có phân bón, thuốc kháng sinh, thuốc trừ sâu hay các thuốc tƣơng tự cũng nhƣ hóa chất. Các bộ phận của cây đƣợc sử dụng trong đề tài bao gồm lá tƣơi và hoa (nếu có), tất cả đều dùng ở dạng tƣơi. Hai loại lá húng quế đƣợc thể hiện trong hình 2.1 và 2.2.
Hình 2.2. Hai loại lá Húng quế
A: Húng quế lá lớn B: Húng quế lá nhỏ 2.1.1.2. Vi sinh vật
Các thử nghiệm đƣợc thực hiện trên 6 chủng vi khuẩn tiêu chuẩn, đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành nhƣ sau:
Escherichia coli ATCC 35218
Staphylococcus areus ATCC 29213 (MSSA)
Staphylococcus areus ATCC 33591 (MRSA)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Streptococcus pyogenes ATCC 19625
2.1.2. Hóa chất
Danh sách hóa chất sử dụng trong đề tài đƣợc trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất sử dụng
STT Hóa chất Nhà sản xuất Nƣớc sản xuất Tiêu chuẩn
1 Nƣớc cất Cemaco Việt Nam Công nghiệp
2 DMSO Merck Đức Công nghiệp
3 Tween 80 Merck Đức Công nghiệp
2.1.3. Môi trƣờng thử nghiệm
Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn: môi trƣờng Brain Heart Infusion Agar (BHA) và môi trƣờng Brain Heart Infusion Broth (BHI).
Môi trƣờng pha loãng vi khuẩn: nƣớc muối sinh lý 0.85% và 0.05% Tween 80. Môi trƣờng thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn (khuếch tán kháng sinh trong thạch từ đĩa giấy và kháng sinh đồ xác định MIC): môi trƣờng Mueller–Hinton Agar (MHA) (Merck) và môi trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA bổ sung 5% máu cừu đối với các chủng S.pyogenes và S.pneumoniae.
Tất cả môi trƣờng sau khi pha xong đƣợc hấp tiệt trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút. Môi trƣờng đã hấp tiệt trùng nhƣng chƣa sử dụng đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở 2 – 8°C.
2.1.4. Thiết bị dụng cụ
Các thiết bị và dụng cụ đƣợc cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, Khoa Dƣợc Trƣờng Đại học Nguyễn Tất Thành. Danh sách các thiết bị sử dụng đƣợc trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh sách thiết bị
STT Thiết bị Model
1 Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV110
2 Tủ sấy Memmert WBU 45 – UM 500
3 Kính hiển vi Optica ANHG 10609 4 Cân điện tử Sartorius Practum 2102 – 1S 5 Tủ cấy vô trùng Esco AVC-4A1
6 Máy vortex Labnet 3412EU 7 Tủ ấm Heraeus
8 Máy đo quang phổ
GeneQuant UV – 1280
9 Bếp đun bình cầu 1 lít
Glassco 1108 – 150
Dụng cụ: đĩa petri Φ 40mm, Φ 60mm, Φ 90mm; que cấy, tăm bông tiệt trùng, đĩa giấy Whatman 6mm, que trải tam giác, đèn cồn và các dụng cụ thủy tinh thông thƣờng trong phòng thí nghiệm.
Dụng cụ dùng trong thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đƣợc hấp tiệt khuẩn ở 121oC trong 20 phút, sấy ở nhiệt độ 80oC, sau đó để ở nhiệt độ phòng cho nguội trƣớc khi sử dụng.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dựa vào mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo các bƣớc nhƣ Sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.2.1. Phƣơng pháp thu hái xử lý dƣợc liệu
Dƣợc liệu sau khi thu hoạch, đƣợc rửa sạch để loại bỏ bụi bám dính và rửa lại bằng nƣớc cất, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau đó dƣợc liệu đƣợc cắt nhỏ vừa phải
Húng quế lá nhỏ Húng quế lá lớn
Thu hoạch sau 35 ngày trồng
Chiết xuất bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn bằng phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán
Tinh dầu
Xác định MIC bằng phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng thạch
và đƣợc dùng để chiết tinh dầu bằng phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc trong vòng 3 giờ bằng bộ chƣng cất tinh dầu. Sau đó, tinh dầu sẽ đƣợc lấy ra và cho vào eppendorf bảo quản trong tủ lạnh 2-8oC.
Phƣơng pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc
Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng đa số với quy mô phòng thí nghiệm. Chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc là một trong các phƣơng pháp đặc biệt của phƣơng pháp chƣng cất đối với các dƣợc liệu nhạy cảm với nhiệt độ nhƣ tinh dầu, nhựa, hydrocacbon,… không hòa tan trong nƣớc và có thể bị phân hủy tại điểm sôi của chúng. Bản chất cơ chế của chƣng cất hơi nƣớc cho ph p một hợp chất hoặc hỗn hợp của các hợp chất đƣợc chƣng cất ở nhiệt độ thấp hơn đáng kể so với điểm sôi của thành phần riêng lẻ. Tinh dầu chứa các chất có điểm sôi lên tới nhiệt độ từ 200°C trở lên, nhờ hơi nƣớc hoặc khi nƣớc sôi các chất có thể bay hơi ở nhiệt độ gần 100°C ở áp suất khí quyển. Nguyên liệu sử dụng trong phƣơng pháp là dƣợc liệu tƣơi hoặc đôi khi sấy khô đƣợc đặt trong bình cầu có dung tích 1000ml có dẫn qua ống sinh hàn. Khi đến nhiệt độ sôi nƣớc đi qua dƣợc liệu dƣới áp suất có thể làm mềm các tế bào và cho ph p tinh dầu thoát ra theo hơi nƣớc dƣới dạng hơi. Nhiệt độ của hơi nƣớc phải đủ cao để làm bay hơi dầu, nhƣng không quá cao để không phá hủy dƣợc liệu hoặc làm kh t tinh dầu. Khi chúng đƣợc giải phóng, những giọt tinh dầu nhỏ bay hơi và cùng với các phân tử hơi nƣớc, đi qua ống hứng tinh dầu. Khi hơi nƣớc nguội đi, nó ngƣng tụ thành nƣớc. Tinh dầu tách lớp và nổi trên mặt chất lỏng [37].
Tiến hành:
Dƣợc liệu sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, đem đi cân và ghi nhận kết quả để tính hiệu suất. Sau đó dƣợc liệu đƣợc cắt nhỏ cho vào bình cầu dung tích 1000ml cùng với 500ml nƣớc cất, lƣợng nƣớc vừa đủ ngập dƣợc liệu. Lắp ráp hệ thống sinh hàn hoàn chỉnh. Thời gian quá trình chƣng cất khoảng 3 giờ. Sau đó lấy lớp tinh dầu nổi phía trên mặt chất lỏng cho vào eppendorf và bảo quản trong tủ lạnh. Mô hình thực hiện phƣơng pháp chứng cất lôi cuốn đƣợc thể hiện trong hình 2.3 và 2.4.
Hiệu suất chiết tinh dẩu:ƣợ ầ đƣợ
ƣợ áđ ế
Hình 2.3. Mô hình chƣng cất lôi cuốn Hình 2.4. Bộ chƣng cất tinh dầu hơi nƣớc
2.2.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 2.2.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn 2.2.2.1. Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn
Tinh dầu đƣợc tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn trình bày ở mục 2.1.1.2, theo phƣơng pháp đĩa giấy khuếch tán, đƣợc qui định tại hƣớng dẫn M44 – A và M02 – A11 của CLSI [23], [30].
2.2.2.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng thử nghiệm
Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là Mueller–Hinton Agar (MHA) và môi trƣờng MHBA (Mueller–Hinton Agar Blood): MHA bổ sung 5% máu cừu đối với vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae. Sau khi pha và hấp tiệt trùng, môi trƣờng đƣợc cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4mm. Thể tích môi trƣờng khoảng 6.5ml/đĩa đối với đĩa Φ
60mm và để thực hiện trên hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae và Tinh dầu Ống sinh hàn Ống hứng tinh dầu Nƣớc Bếp đun Bình cầu
20ml/đĩa đối với đĩa Φ 90mm với các chủng vi khuẩn thƣờng. Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, nếu chƣa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ 4 – 8°C. Khi sử dụng, nếu đĩa ƣớt, để đĩa trong tủ ấm tối đa 30 phút cho đĩa khô hoàn toàn.
2.2.2.1.2. Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn chuẩn sau khi cấy hoạt hóa trên đĩa thạch BHA và BHA bổ sung 5% máu cừu đối với chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae đƣợc ủ ở 37°C trong 24 giờ.
Chọn 3-5 khóm vi khuẩn giống nhau tách rời, dùng vòng cấy vô trùng lấy các khóm cho vào ống chứa dung dịch nƣớc muối sinh lý 0,85% có thêm 0,05% Tween 80 và phân tán đều bằng máy vortex. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bƣớc sóng 625nm. Giá trị này tƣơng đƣơng với khoảng 1 – 2 x 108 CFU/ml. Vi khuẩn sau khi pha xong phải sử dụng trong vòng 30 phút.
2.2.2.1.3. Chuẩn bị chất thử
Tinh dầu đƣợc tẩm lên các đĩa giấy đƣờng kính 6mm với lƣợng là 3l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 60mm, 7l/đĩa giấy đối với đĩa Φ 90mm.
2.2.2.1.4. Tiến hành khảo sát
Trong vòng 15 phút sau khi pha huyền dịch vi khuẩn, dùng que bông vô trùng nhúng vào ống huyền dịch vi khuẩn. Trải vi khuẩn lên môi trƣờng thử nghiệm bằng que bông. Huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải theo đƣờng zic-zac sát nhau đến giữa đĩa petri, sau đó xoay mặt thạch 600 rồi tiếp tục trải zic-zac nhƣ lần trên, rồi xoay tiếp 600 và trải các đƣờng sát nhau nhƣ vậy đến khi huyền dịch vi khuẩn đƣợc trải đều trên toàn bộ mặt thạch. Lần cuối cùng xoay tròn que bông xung quanh thành đĩa để vi khuẩn đƣợc trải đều.
Đặt đĩa giấy đã tẩm tinh dầu lên bề mặt môi trƣờng bằng kẹp vô trùng. Sau khi đặt đĩa dùng kẹp nhấn nhẹ đĩa xuống mặt thạch để đảm bảo đĩa tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa giấy, phải ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 35 – 37°C trong 24 giờ. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Chất thử có tác động kháng khuẩn sẽ cho vòng tròn ức chế đồng nhất. Đo và ghi nhận đƣờng kính vòng ức chế kể cả đƣờng kính của đĩa tẩm tinh dầu bằng thƣớc kẹp có độ chia nhỏ nhất là 0,01mm.
Khả năng kháng mạnh hay yếu đƣợc đánh giá sơ bộ bằng giá trị đƣờng kính vòng ức chế theo Bảng 2.3 [47].
Bảng 2.3. Mức độ kháng vi sinh vật dựa vào đƣờng kính vòng ức chế Đƣờng kính vòng ức chế vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật
> 14 Mạnh
10 – 14 Vừa
7 – 9 Yếu
6 Không kháng
2.2.2.2. Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật (MIC)
Tinh dầu có tác động ức chế sẽ đƣợc thử nghiệm tìm MIC bằng phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn [45], [46]; mỗi thử nghiệm thực hiện lặp lại 6 lần.
2.2.2.2.1. Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm
Tƣơng tự với mục 2.2.2.1.2. Sau đó, huyền dịch trên tiếp tục đƣợc pha loãng 10 lần để đạt mật độ vi khuẩn tƣơng ứng với 107
CFU/ml.
Vi khuẩn sau khi đƣợc pha chế phải đƣợc sử dụng ngay trong vòng 30 phút. 2.2.2.2.2. Môi trƣờng
Môi trƣờng tốt nhất để thực hiện phƣơng pháp pha loãng môi trƣờng thạch xác định MIC là MHA (Mueller-Hinton Agar). Chất thử nghiệm đƣợc hút chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO 1%. Chuẩn bị sẵn 1 dãy gồm 11 đĩa petri Φ 40mm vô trùng và đánh số từ 1 đến 10 ở đáy đĩa; đĩa số 11 đƣợc ký hiệu là đĩa chứng và không cho chất thử vào. Tiến hành pha loãng trong môi trƣờng thử nghiệm sao cho tạo thành dãy có nồng độ sau bằng 1/2 nồng độ trƣớc. Đối với hai chủng vi khuẩn S.pyogenes và S.pneumoniae, khi tiến hành pha loãng cho thêm vào mỗi ống 5% máu cừu. Khoảng nồng độ cần pha phụ thuộc vào MIC dự đoán của chất thử. Sử dụng máy vortex để đảm bảo trộn đều chất thử trong môi trƣờng. Đổ vào đĩa petri và chờ thạch đông.
2.2.2.2.3. Tiến hành khảo sát
Chấm 1µl dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt đƣợc mật độ vi khuẩn trên đĩa thạch là 104 CFU/ml. Các đĩa thạch đƣợc để ngửa để dịch cấy trên các điểm cấy thấm hoàn toàn lên mặt thạch khoảng 10-15 phút. Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
2.2.2.2.4. Đọc kết quả
Đọc kết quả sau 18 – 24 giờ. Tìm đĩa có nồng độ thấp nhất ức chế hoàn toàn sự tạo khóm, nồng độ của đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp hơn, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại.
2.2.2.3. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
2.2.2.3.1. Môi trƣờng
Môi trƣờng sử dụng cho phƣơng pháp này là BHA bổ sung 5% máu cừu đối với
S.pyogenes và S.pneumoniae và BHA đối với các chủng vi khuẩn còn lại.
2.2.2.3.2. Tiến hành khảo sát
Trên các đĩa thạch đã thực hiện MIC, chọn các đĩa có nồng độ nhƣ sau: 1 đĩa ngay nồng độ MIC và 2 đĩa có nồng độ gấp 2, gấp 4 lần MIC.
Dùng dao đầu nhọn đã tiệt trùng cắt phần thạch đã chấm vi khuẩn trên các đĩa đƣợc chọn làm MBC. Sau đó cho vào mỗi eppendorf 100µl nƣớc muối sinh lý có thêm 0,05% Tween 80, vortex kỹ. Hút huyền dịch trong eppendorf cho vào đĩa môi trƣờng đã đƣợc hấp tiệt trùng sẵn. Dùng que trải thủy tinh tam giác phân tán đều huyền dịch trên mặt thạch cho đến khi mặt thạch hoàn toàn khô.
Ủ ở nhiệt độ 35 – 37°C, nếu có vi khuẩn thì chúng sẽ mọc thành các khóm trên mặt thạch. Thử nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần.
2.2.2.3.3. Đọc kết quả
Đọc kết quả sau 16 – 18 giờ. Tính số khóm trung bình trên một hộp thạch ở cùng nồng độ. MBC là nồng độ mà tại đó diệt 99,9% vi khuẩn thử nghiệm. Tìm đĩa có tổng số khóm dƣới 10, nồng độ của đĩa thạch này là MBC của chất thử đối với vi
khuẩn thử nghiệm. Nếu có vi khuẩn mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể do bị nhiễm và thử nghiệm phải đƣợc thực hiện lại.
2.2.3. Xử lý số liệu thống kê
Đề tài sử dụng phần mềm phân tích xử lý số liệu thống kê MINITAB 18.1. Mục đích của đề tài khi sử dụng xử lý thống kê đó là đánh giá sự khác biệt của hai loại lá húng quế. Tất cả các thí nghiệm đƣợc thực hiện sáu lần cho mỗi loài vi khuần đối với phƣơng pháp khuếch tán trên thạch, phƣơng pháp pha loãng trong môi trƣờng rắn để xác định nồng độ MIC và trải đĩa để xác định MBC. Kết quả sau sáu lần thực hiện đƣợc xử lý bằng Nonparametrics test với phƣơng pháp Mann-Whitney để xem xét và phân tích ý nghĩa thống kê sự khác biệt về hoạt tính kháng khuẩn giữa húng quế lá nhỏ và húng quế lá lớn. Kết quả có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05, điều