2.2.3.1. Chuẩn bị cao chiết
Mẫu lá Sài đất ba thùy không sâu bệnh đƣợc thu hái trên đƣờng Nguyễn Hữu Thọ, Quận 7, TP.HCM. Mẫu cây đƣợc rửa sạch, nhặt hết lá cho vào trong tủ sấy ở nhiệt độ 60 - 70o
C trong 6 giờ. Sau khi lá khô, xay lá thành bột thô.
Cân 100g mẫu, chia thành 2 phần bằng nhau. Phần 1 chiết với 500ml methanol bằng cách đun sinh hàn hồi lƣu ở nhiệt độ 60 - 70oC trong vòng 1 giờ. Dịch chiết đƣợc đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40o
C để thu đƣợc cao methanol. Phần 2 chiết tƣơng tự với 500ml dung môi chloroform, đem cô quay ở nhiệt độ 37oC.
Cao toàn phần sau khi cô đƣợc tính hiệu suất theo công thức sau:
Trong đó:
H: hiệu suất chiết xuất (%)
mcao: khối lượng cao sau cô quay (g) mmẫutươi: khối lượng mẫu tươi (g)
2.2.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn – kháng nấm của cao methanol Sài đất ba thùy bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
a. Pha mẫu: Cân chính xác 50mg cao chiết methanol cho vào eppendoff, hòa tan trong 1ml dung môi DMSO 10%. Thực hiện tƣơng tự với cao chloroform [27]. b. Chuẩn bị môi trƣờng: Môi trƣờng MHA đƣợc nấu chảy và đổ hộp sao cho có đƣợc lớp thạch dày khoảng 3 - 4 mm [27].
c. Chuẩn bị vi sinh vật: Cấy ria vi khuẩn thử nghiệm trên môi trƣờng thạch TSA, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 3 – 5 khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào môi trƣờng TSB. Ủ từ 2 – 6h ở 37oC để hoạt hóa vi khuẩn. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nƣớc muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn vortex. Điều chỉnh dịch
treo bằng máy đo OD ở bƣớc sóng 600 nm về giá trị OD 0,1 (0,08 – 0,12) thì trải đều lên môi trƣờng MHA đã chuẩn bị trƣớc. Dịch nấm thực hiện tƣơng tự nhƣng với một số thay đổi nhƣ sau: môi trƣờng tăng sinh: SDA, SDB và môi trƣờng thử nghiệm: SDA. Huyền dịch vi nấm đƣợc điều chỉnh về giá trị OD 0,08 – 0,12 tại bƣớc sóng 530 nm [27].
d. Tiến hành: Đĩa thạch đƣợc để khô 3 – 5 phút trƣớc khi đục các lỗ giếng đƣờng kính 6 mm với khoảng cách thích hợp trên đĩa thạch đã trải vi khuẩn.
Hút chính xác 50µl dung môi methanol làm chứng âm vào giếng (1). Giếng (2): 50µl dung môi chloroform làm chứng âm cho dịch chiết chloroform. Giếng (3): 50µl DMSO 10%. Giếng (4) là chứng dƣơng với chất thử là ciprofloxacin (cip) 10 µg/giếng cho vi khuẩn và fluconazole (flu) 10 µg/giếng cho vi nấm. Giếng (5): 50µl dịch chiết methanol (nồng độ tƣơng đƣơng 2500µg/giếng). Giếng (6): 50µl dịch chiết chloroform (nồng độ tƣơng đƣơng 2500µg/giếng). Sau đó để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35 – 37oC trong 16 - 18 h đối với vi khuẩn và trong 48 giờ đối với Candida spp. Nếu vi khuẩn là MRSA thì ủ trong 24 giờ [27].
Đọc kết quả khi:
- Đĩa chứng âm không ức chế sự phát triển của vi khuẩn. - Đĩa chứng dƣơng ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
- Chất thử có khả năng kháng khuẩn khi xung quang lỗ có vòng kháng khuẩn [27].
Bảng 2.1.Bảng đánh giá mức độ kháng vi sinh vật Đƣờng kính vòng kháng vi sinh vật (mm) Mức độ kháng vi sinh vật ≥ 15 Mạnh 10 – 14 Vừa < 9 Yếu 0 Không kháng
Chƣơng 3. Kết quả và bàn luận 3.1. Mô tả dƣợc liệu
Lá tƣơi Sài đất và Sài đất ba thuỳ dùng để mô tả không già quá cũng không non quá, đƣợc rửa sạch, quan sát và lập bảng so sánh giữa 2 loài. (Xem bảng 3.1)
Bảng 3.1. Mô tả đặc điểm lá hai loài Sài đất
Sài đất ba thùy Sài đất
Lá tƣơi
Lá xẻ thùy chân vịt, phiến lá xẻ 3 thùy, khía sâu ½ phiến lá, dài từ 5-9cm, rộng từ 2-5cm, phiến lá không dày, có tính dai kém, đầu lá nhọn, mép lá có răng cƣa đều hai bên thùy. Phía cuống ngắn, dƣờng nhƣ không có. Từ cuống lá tỏa ra 3 gân chính rõ rệt. Mặt trên phiến lá màu xanh lục đậm, nhám, lông mọc thƣa thớt, mặt dƣới xanh lục nhạt, ba gân nổi rõ, lông mịn, dài mọc thƣa thớt.
Lá mọc đối không cuống, hình bầu dục, thon, dài 1,5-5 cm, rộng 0,8-2 cm. Mép lá thƣờng có 1- 3 răng to và nông. Hai mặt lá có lông cứng, mặt trên màu xám lục, có chấm trắng, mặt dƣới màu nhạt hơn, có gân hơi nổi lên.
Bột lá
Bột lá mịn, màu xanh xám, mùi thơm nhẹ, vị đắng nhẹ.
Màu lục xám, vị hơi mặn, hơi đắng.
A. Lá Sài đất ba thùy tƣơi B. Hình dạng lá giữa 2 loài C. Bột lá Sài đất ba thùy
Thân Sài đất và Sài đất ba thuỳ dùng để mô tả gồm cả thân non và thân già đƣợc rửa sạch, quan sát và lập bảng so sánh giữa 2 loài. (Xem bảng 3.2)
Bảng 3.2. Mô tả đặc điểm thân cây hai loài Sài đất
Sài đất ba thùy Sài đất
Thân tƣơi
Thân bò, dài 10 – 30cm, màu hơi đỏ hoặc xanh, tròn, rễ mọc tại các đốt. Thân non giòn, nhiều lông che chở mảnh mịn, thân xanh hơn. Thân già dai, láng, ít hoặc không còn lông che chở, màu sẫm, các đốt mọc nhiều rễ.
Thân màu xanh, mọc bò, lan tới đâu mọc rễ tới đó, mang lông trắng cứng nhỏ.
Bột thân
Bột màu vàng nhạt, thô ráp, không có vị gì đặc biệt.
Bột màu xanh lục, vị hơi mặn, có mùi thơm, dễ chịu.
A. Thân non Sài đất ba thùy B. Bột thân Sài đất ba thùy
C. Thân già Sài đất ba thùy D. So sánh hình dạng thân giữa 2 loài
Do Sài đất thu hái không có hoa nên mô tả hình thái đƣợc tham khảo từ khoá luận tốt nghiệp dƣợc sĩ của Tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền [4. (Xem bảng 3.3)
Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm hoa hai loài Sài đất
Sài đất ba thuỳ Sài đất
Cụm hoa: dạng đầu, đƣờng kính 3-4cm, cuống cụm hoa dài 7-15cm, có lông thô, ngắn. Tổng bao lá bắc xếp 2 tầng. Các phiến tầng ngoài và trong tƣơng tự nhau: chất lá màu xanh, đỉnh nhọn, dài khoảng 10-12mm, rộng 3-4mm.
Hoa cái: dạng lƣỡi nhỏ dài 8,5-10mm, rộng 3,5-4mm, màu vàng đậm, đỉnh chia 3 thuỳ răng, bầu hoa cái ngắn, nhỏ. Có từ 12-14 hoa ở viền.
Hoa lưỡng tính: tràng dạng ống dài 4- 4,5mm, đầu ống loe 5 thuỳ ngắn, có nhiều gai nhỏ màu vàng. Có từ 40-43 hoa lƣỡng tính.
Cụm hoa: dạng đầu đƣờng kính 20-25mm, cuống cụm hoa dài 2-6cm, có lông thô, ngắn. Tổng bao lá bắc xếp 2 tầng. Các phiến tầng ngoài chất lá, màu xanh, đỉnh tù, dài khoảng 9mm, rộng 3,5-4mm. Các phiến tầng trong ngắn hơn, dài khoảng 6mm, rộng 2-3mm [4.
Hoa cái: dạng lƣỡi nhỏ, dài 8,5-10mm, rộng 3,5-4mm, màu vàng tƣơi, đỉnh có 2-3 răng, khía sâu 1mm. Có từ 12-16 hoa cái trên đầu [4.
Hoa lưỡng tính: tràng dạng ống loa dần lên phía trên chia 5 thùy ngắn, dài 3mm. Phần trên cùng. Nhị 5. Có từ 30-40 hoa lƣỡng tính [4.
A. Cụm hoa B. Hoa cái C. Hoa lƣỡng tính
Nhận xét:
Qua mô tả nhận thấy đặc trƣng quan trọng để phân biệt Sài đất và Sài đất ba thuỳ là đặc điểm về lá, trong khoá phân loại Thực vật chí của Trung Quốc và Đài Loan cũng nêu rõ sự khác biệt về lá giữa hai loài [4].
3.2. Kiểm nghiệm vi học
3.2.1. Vi phẫu lá Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.)Hitchc.)
Lá tƣơi lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và có một phần phiến lá ở hai bên. Sau khi cắt và nhuộm đƣợc kết quả vi phẫu (Xem hình 3.4)
Mô tả
Gân giữa: mặt dƣới lồi hơn mặt trên. Từ trên xuống gồm:
- Biểu bì trên và biểu bì dƣới là một lớp tế bào sống, hình bầu dục hoặc gần tròn, kích thƣớc không đều. Trên biểu bì đôi khi có lông tiết, lông che chở. Lông tiết là những tế bào biểu bì mọc dài ra, mỗi lông tiết gồm 1 chân và 1 đầu kiểu đơn bào. Lông che chở dạng đa bào đầu nhọn.
- Dƣới biểu bì là mô dày góc, đám mô dày góc ở biểu bì trên và dƣới đều mỏng (1- 2 lớp tế bào) là những tế bào sống, hình đa giác không đều, dày lên ở góc, sắp xếp lộn xộn.
- Mô mềm khuyết có kích thƣớc không đều, hình tròn hoặc đa giác, sắp xếp để hở những khoảng lớn. Sau đó là mô mềm đạo gồm các tế bào gần tròn hoặc đa giác, sắp xếp không khít nhau mà để hở những khoảng trống nhỏ. Rải rác trong vùng này có 7-9 ống tiết ly bào tập trung đều ở mặt trên và mặt dƣới lá.
- Có 5 bó libe – gỗ rời nhau xếp thành hình cung cân đối: bó ở giữa to nhất, hai bó cạnh bên nhỏ hơn, một cung libe – gỗ gồm: Gỗ 1 ở trên là những mạch gỗ hình đa giác, vách hóa gỗ, xếp thành từng dãy, mạch nhỏ ở trên, mạch lớn ở dƣới. Libe 1 gồm những tế bào nhỏ hình đa giác, sắp xếp lộn xộn, bao lấy Gỗ 1.
Phiến lá: có cấu tạo dị thể.
-Tế bào biểu bì trên to, hình chữ nhật và rải rác vài lông tiết, biểu bì dƣới tế bào nhỏ hơn, hình đa giác và dẹt.
-Mô mềm giậu: một lớp tế bào hình bầu dục hoặc hơi đa giác, ngắn, xếp khít nhau và vuông góc với biểu bì.
-Mô mềm đặc (3-4 lớp): tế bào hình đa giác, vách uốn lƣợn, xếp khít nhau.
A.Biểu bì trên, mô dày góc và mô mềm khuyết
B. Lông che chở đa bào đầu nhọn
C. Lông tiết đơn bào
D. Mô mềm đạo và ống tiết ly bào
E. Bó libe – gỗ cấu tạo cấp 1
F. Mô mềm khuyết và mô mềm đặc
Hình 3.5. Các thành phần trong vi phẫu lá Sài đất ba thùy
Bóc tách biểu bì lá
- Biểu bì trên: tế bào đa giác vách uốn lƣợn, không thấy lỗ khí, đôi khi gặp lông tiết hay lông che chở (Xem hình 3.6).
- Biểu bì dƣới: tế bào vách uốn lƣợn, nhiều lỗ khí kiểu hỗn bào gồm 3-4 tế bào bạn không đều bao quanh lỗ khí (Xem hình 3.6).
3.2.2. Vi phẫu lá Sài đất ( Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr.)
Lá tƣơi lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và có một phần phiến lá ở hai bên. Sau khi cắt và nhuộm đƣợc kết quả vi phẫu (Xem hình 3.7)
Mô tả
Phần gân lá:
-Biểu bì trên và dƣới gồm một lớp tế bào nhỏ tƣơng đối tròn, xếp đều đặn, trên biểu bì thƣờng có lông tiết chân đa bào, đầu đơn bào.
-Dƣới biểu bì là mô dày góc gồm 2-3 lớp, đám mô dày ở biểu bì dƣới dày và rộng hơn đám mô dày ở biểu bì trên.
-Mô mềm đặc: là những tế bào hình đa giác thành mỏng không đều nhau.
-Ở giữa gân lá có một bó libe - gỗ to, có lớp libe hình cung bao dƣới bó gỗ. Trong gân lá có thể có khoảng 3 bó libe – gỗ xếp theo hình cung.
Phần phiến lá: có cấu tạo dị thể
-Biểu bì trên gồm 1 lớp tế bào to, hình chữ nhật và rải rác vài lông tiết, biểu bì dƣới tế bào nhỏ hơn, hình đa giác và dẹt.
-Mô giậu: 1 lớp tế bào hình chữ nhật to đều, xếp khít nhau. -Dƣới mô giậu là mô mềm đặc.
(Xem chi tiết các thành phần vi phẫu hình 3.8)
A. Lông tiết đa bào, biểu bì và mô dày góc
B. Mô mềm giậu C. Bó libe – gỗ
Hình 3.8. Các thành phần trong vi phẫu lá Sài đất
Sau khi đã quan sát và mô tả vi phẫu giữa hai loài. Lập bảng so sánh các thành phần có ở biểu bì, gân lá và phiến lá giữa hai loài. (Xem bảng 3.4)
Bảng 3.4. Bảng so sánh vi phẫu lá cây giữa 2 loài
Sài đất ba thùy Sài đất
Phần gân
lá
Biểu bì trên và biểu bì dƣới gồm 1 lớp tế bào hình bầu dục hoặc gần tròn, kích thƣớc không đều, bên ngoài phủ lớp cutin mỏng. Trên biểu bì đôi khi có lông tiết, lông che chở.
Biểu bì trên và dƣới gồm 1 lớp tế bào nhỏ tƣơng đối tròn, trên biểu bì thƣờng có lông tiết chân đa bào, đầu đơn bào.
Mô dày góc ở biểu bì trên và dƣới đều mỏng (1-2 lớp tế bào)
Mô dày góc: gồm 2-3 lớp, đám mô dày dƣới biểu bì dƣới dày và rộng hơn đám mô dày dƣới biểu bì trên.
Mô mềm khuyết có kích thƣớc không đều, hình tròn hoặc đa giác.
Mô mềm đặc: tế bào hình đa giác thành mỏng không đều nhau.
Mô mềm đạo gồm các tế bào gần tròn hoặc đa giác, kích thƣớc không đều. Rải rác trong vùng này có 7-9 ống tiết ly bào tập trung đều ở mặt trên và mặt dƣới lá.
Có 5 bó libe – gỗ (3 bó libe – gỗ to ở gân chính và 2 bó libe – gỗ nhỏ ở 2 bên gân phụ) rời nhau xếp thành hình cung cân đối: bó ở giữa to nhất, hai bó cạnh bên nhỏ hơn.
Một bó libe - gỗ to, có lớp libe hình cung bao dƣới bó gỗ. Trong gân lá có thể có khoảng 3 bó libe-gỗ xếp theo hình cung.
Phần phiến
lá
Tế bào biểu bì trên to, hình chữ nhật và rải rác vài lông tiết, biểu bì dƣới tế bào nhỏ hơn, hình đa giác và dẹt.
Tế bào biểu bì trên lớn hơn tế bào biểu bì dƣới, trên biểu bì có lông tiết đầu đơn bào, lông che chở đa bào.
Mô mềm giậu: một lớp tế bào hình bầu dục hoặc hơi đa giác, ngắn, xếp khít nhau và vuông góc với biểu bì.
Mô giậu, gồm 1-2 lớp tế bào hình chữ nhật to đều đặn, xếp khít nhau.
Mô mềm đặc: 3-4 lớp Mô mềm đặc: 5-6 lớp
Nhận xét:
Sau quá trình soi kính hiển vi và mô tả vi phẫu lá nhận thấy sự khác biệt đặc trƣng giữa hai loài nằm ở lông tiết và có một ít khác biệt ở lông che chở, mô mềm, số lƣợng bó libe – gỗ ở phần gân lá. Phần phiến lá không có nhiều khác biệt.
3.2.3. Vi phẫu thân Sài đất ba thùy ( Wedelia trilobata (L.) Hitchc.)
Mẫu thân cây chọn đoạn không quá già cũng không quá non, cắt theo phẫu thức ngang và nhuộm. Kết quả đƣợc vi phẫu thân Sài đất ba thuỳ. (Xem hình 3.9)
Mô tả: vùng vỏ chiếm 1/3 và vùng trung trụ chiếm 2/3 bán kính vi phẫu. Vùng vỏ gồm:
-Biểu bì là 1 lớp tế bào đa giác, kích thƣớc không đều, bên ngoài phủ 1 lớp cutin mỏng, vách tẩm cellulose. Trên biểu bì có thể có lỗ khí, lông tiết hoặc lông che chở. Lông che chở đa bào đầu nhọn gồm 3-4 tế bào.
-Dƣới biểu bì là mô dày góc có vách tẩm cellulose dày lên ở các góc, tập trung đều thành vòng tròn dƣới biểu bì (khoảng 2-3 lớp). Các tế bào mô dày ở dạng hình đa giác không đều, kích thƣớc không đều và sắp xếp lộn xộn.
-Dƣới mô dày là mô mềm khuyết (7-8 lớp tế bào) có vách bằng cellulose, kích thƣớc không đều, hình tròn hoặc đa giác, sắp xếp để hở những khoảng lớn. Rải rác vùng này có nhiều ống tiết ly bào và tế bào tiết to, màu vàng, không đều, nằm gọn trong các tế bào.
-Nội bì: là một lớp tế bào sống trong cùng của mô mềm vỏ, gồm những tế bào hình chữ nhật, dẹt, xếp khít nhau.
Vùng trung trụ gồm:
-Trụ bì: hoá mô cứng thành từng cụm trên đầu bó libe gỗ, tế bào hình đa giác, vách dày, xếp khít nhau.
-Vòng mô dẫn liên tục. Libe ở trên, Gỗ ở dƣới phân hóa ly tâm.
-Libe 1: ở trên, là lớp tế bào mỏng dẹt, móp méo, sắp xếp lộn xộn, vách tẩm cellulose, tập trung thành cụm do Libe 2 chèn ép.
-Libe 2: ở dƣới, gồm nhiều dãy tế bào hơi dẹp, xếp thành dãy xuyên tâm.