5. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
2.3.2. Phân tích metacercariae trên cá
Phương pháp phân tích metacercariae
Mẫu cá giống và cá thịt thu về được kiểm tra metacercariae bằng phương pháp tiêu cơ [31].
- Cân, đo cá và ghi số liệu.
- Tách riêng từng bộ phận, cơ quan của cá đối với cá thịt (mỗi mẫu cân từ 50 - 100g), cịn cá giống thì xử lý nguyên con.
- Nghiền nhỏ mẫu bằng cối chày sứ hoặc máy xay sinh tố.
- Chuyển mẫu vào cốc thủy tinh cĩ dung tích 100ml, trong cốc cĩ chứa 50ml dung dịch dạ dày nhân tạo (6g pepsin +8 ml HCl + 1 lít nước cất).
- Khuấy đều đặt trong tủ ấm 370 C trong 2 - 3 giờ.
- Mẫu được lọc qua lưới lọc 1x1mm và rửa sạch bằng nước muối sinh lý (0.86%).
- Loại bỏ phần nổi một cách nhẹ nhàng và giữ lại phần lắng cặn.
- Lặp lại từ 9 - 10 lần cho đến khi phần nước trở nên trong suốt, thấy được phần cặn lắng bên dưới cốc.
- Di chuyển một ít phần cặn bỏ vào đĩa lồng petri chứa 6 - 7ml nước muối sinh lý. Dùng tay lắc nhẹ đĩa lồng petri để cho phần cặn lắng vào giữa đĩa. Dùng pipet cĩ gắn quả bĩp bằng cao su lấy đi một phần dịch. Làm lại bước này cho đến khi tất cả Metacercaria tập trung vào giữa đĩa lồng.
- Quan sát và nhận dạng metacercaria và tính tốn số metacercaria cho mỗi lồi sán.
Phương pháp nhận dạng ấu trùng metacercariae
Sử dụng kính hiển vi quang học để định danh lồi metacercariae theo tiêu chuẩn hình thái [15].
- Quan sát metacercariae.
Phân loại metacercariae: quan sát metacercariae dưới kính soi nổi, chọn lọc và tách các loại metacercariae cĩ đặc điểm giống nhau và chung một đĩa lồng petri.
Di chuyển metacercariae vào lam kính, sau đĩ đậy lamel lên rồi soi dưới kính hiển vi để quan sát hình thái.
Nhận diện metacercariae dựa vào đặc điểm khĩa hình thái học định loại ấu trùng sán metacercaria: dựa trên đặc điểm hình thái (hình dạng nang, bề dày, thành nang cĩ một hay hai lớp, ấu trùng cĩ điểm mắt hay khơng, nếu cĩ thì cĩ một hay 3 điểm mắt, thể hiện giác bám và kích thước giác bám cĩ hay khơng các mĩc bám xung quanh các giác bám miệng, hình dạng các cơ quan bài tiết, cĩ hay khơng các loại hạt trong hệ thống bài tiết, cơ quan sinh sản).
- Phá nang metacercariae thường rất khĩ xác định đến mức giống của metacercariae trong khi các đặc điểm hình thái đặc biệt của sán trưởng thành là những đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại. Dùng phương pháp ép vật lý ép nhẹ nang metacercariae trên lam kính hiển vi để metacercariae thốt khoải nang rồi quan sát.