1.4.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nồng độ DNA khuôn mẫu cần phải có tỉ lệ cân bằng với nồng độ các thành phần khác trong phản ứng PCR, đặc biệt là nồng độ các đoạn mồi. Thông thường, người ta dùng nồng độ DNA khuôn mẫu trong khoảng từ 10-100ng/25µL dung dịch phản ứng, nồng độ mồi không quá 0,5 µM (12,5 pmol/ 25 µL)
Enzyme tổng hợp
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polimerase I. Sau này được thay thế bằng DNA polimerase chịu nhiệt được tách chiết từ một loại vi khuẩn sống ở suối nước nóng Thermus aquaticus, đó là Taq polimerase, không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt động của Taq pol là 72-80P
0
P
C.
Mồi (Primer)
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu quả cao. Trình tự của mồi được chọn xác định kích thước và vị trí sản phẩm PCR cũng như Tm của vùng khuếch đại.
Nhiệt độ lai (nhiệt độ ủ)
Nhiệt độ ủ thích hợp là nhiệt độ sao cho ở đó có ½ số primer sẽ gắn với DNA khuôn mẫu. Công thức dưới đây ứng dụng trong trường hợp primer có khoảng 20 nucleotide: TR aR = 4 (G+C) + 2 (A+T) – 5P o P C Nucleoside triphosphate
Bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/ mỗi loại nucleotid. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại kí sinh. Sự mất cân bẳng trong thành phần các nucleotid lại làm tăng các lỗi sao chép của polimerase.
Nồng độ MgP 2+ Nồng độ MgP 2+ P (MgClR
2R) có thể ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính của DNA khuôn mẫu, quá trình ủ của mồi, tính đặc hiệu của sản phẩm PCR, hoạt tính của Taq polvà độ chính xác của kết quả. Nồng độ thích hợp của MgP
2+
Plà từ 0,5-2,5mM ứng với nồng độ dNTP tổng số đã cho.
26T
1.5. GEN IPT26T
Gen ipt (isopentenyl transferase) hiện diện trong plasmid của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens 34T(Akiyoshi và cs., 1984) 34Tvới tên là: gen pga22, được chèn bởi một intron có 252 bp, mã hóa cho một polypeptide chứa 329 amino acid, trọng lượng phân tử là 37.2 kd. Gen này được tìm thấy nằm ở vị trí thứ 4 trong plasmid gây khối u của vi khuẩn A. tumefaciens, mã hóa cho enzyme isopentenyl transferase. [65]
1.5.1. Một số nghiên cứu chuyển gen ipt
Các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt của các tác giả Gan và cs. (1996); Wang và cs. (1997) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) cho thấy hàm lượng cytokinin tăng lên trong cây chuyển gen và do đó làm chậm sự lão hoá của lá và hoa.
Năm 2001, công trình "Ảnh hưởng của biểu hiện gen iptpromoter SAG12 đối với sự phát triển và lão suy ở cây cải xà lách (Lactuca sativa L. cv. ‘Evola’) chuyển gen", tác giả Matthew S. McCabe và cs. thực hiện chuyển gen ipt điều khiển bởi promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn A. tumefaciens trên lá mầm cây cải xà lách. Kết quả cho thấy hàm lượng cytokinin tăng trong cây chuyển
gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá trong quá trình phát triển cây cũng như sau thu hoạch của cây chuyển gen.
Hợp chất artemisinine và dẫn suất của chúng là hoạt chất của cây thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.) có tác dụng chữa nhiều loại bệnh và đặc trị đối với bệnh sốt rét. Năm 2001, Geng S và cs. đã nghiên cứu ảnh hưởng của sự biểu hiện gen ipt đến đặc tính lý hóa của cây thanh hao chuyển gen. Kết quả cho thấy, cây chuyển gen iptcó mức cytokinin (iPA và iP) tăng gấp 2-3 lần, đồng thời lượng diệp lục tố tăng 20-60%, lượng artemisinine tăng 30-70%.
Năm 2003, công trình "Sản xuất thừa các cytokinins trong hoa cây thuốc lá cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy tràng hoa và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene", Hsiang Chang và cs. đã nghiên cứu chuyển gen ipt điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây hoa Dã Yên (Petunia hybrida cv. ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả cho thấy hoa của các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây chuyển gen kém mẫn cảm hơn đối với ethylen ngoại sinh.
Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng (Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão suy SAG12" do Ornella Calderini và cs. thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc. Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens.
Một nghiên cứu gần đây do hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và Nhật Bản (Rivero và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống chịu được hạn hán bằng phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá. Các nhà nghiên cứu hy vọng phát hiện này sẽ giúp giảm những thiệt hại về mùa màng do hạn hán và cho phép sản xuất lương thực tại các vùng thiếu nước.
1.5.2. Cơ chế tác dụng của gen ipt
Chất điều hòa sinh trưởng cytokinin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý ở thực vật (Mok Mok, 2001; Riefler và cs., 2006). Sự biểu hiện của gen ipt trong thực vật chuyển gen đưa đến sự gia tăng hàm lượng cytokinin nội sinh. [34], [60], [94]
Enzyme isopentenyl transferase do gen ipt mã hóa sẽ tham gia thủy giải bước đầu tiên trên con đường sinh tổng hợp cytokinin, thêm nhóm isopentenyl pyrophosphate đến N6 của 5’-AMP để hình thành isopentenyl AMP. [44]
34T
Hình 1.8. Sơ đồ tạo cytokinin trong thực vật dưới tác dụng của gen ipt
34T
(iPMP: isopentenyladenosine 5’-monophosphate, AMP: adenosine 5’- monophosphate, DMAPP: dimethylallylpyrophosphate, ipt: isopentenyl transferase, iPA: isopentenyladenosine, ZR: zeatin riboside, ZMP: zeatin monophosphate).
1.6. NUÔI CẤY TẾ BÀO – SẢN XUẤT HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.6.1. Hợp chất thứ cấp và nuôi cấy mô, tế bào
Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp được sinh tổng hợp từ sản phẩm trao đổi chất sơ cấp, phân bố hạn chế ở một số loài trong giới thực vật. Mặc dù không có vai trò đáng kể trong chuyển hóa cơ bản (con đường chuyển hóa chính của thực vật) do không phải là chất dinh dưỡng, không trực tiếp cần thiết cho sự phát triển của thực vật, nhưng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp có ý nghĩa sinh thái quan trọng, giúp thực vật tương tác với môi trường và sống sót trước áp lực chọn lọc của môi trường. [38]
Những nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật phát triển từ những năm 1950. Có khoảng 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất như các alkaloid, terpenoid, saponin… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất thứ cấp thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào đặc biệt (tế bào rễ tơ, biểu mô, hoa, lá…) và trong những giai đoạn phát triển nhất định, thường trong điều kiện đáp ứng với stress môi trường. [31], [38]
Có nhiều khó khăn trong việc thu nhận một lượng lớn các hợp chất tự nhiên từ thực vật. Đồng thời, nguồn tài nguyên thực vật ngày càng bị thu hẹp, nhiều loài có nguy cơ tuyệt chủng, dẫn đến khó khăn trong việc sử dụng các sản phẩm từ thực vật. Do đó, cần thiết phải có một phương thức sản xuất khác để cung cấp các sản phẩm này. Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có tiềm năng to lớn cho ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Năm 1959, báo cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào thực vật trên quy mô lớn đã được công bố bởi Tulecke và Nickell (Mỹ). Trong số các sản phẩm thứ cấp có nguồn gốc từ tế bào thực vật, các hoạt chất rất có giá trị như shikonin, ginsenosid và berberin đã được sản xuất trên quy mô lớn, và đây thực sự là những thành công rực rỡ trong công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật. [27], [31], [38]
1.6.2. Quy trình nuôi cấy tế bào sản xuất hợp chất thứ cấp
Quy trình nuôi cấy tế bào để chiết xuất hợp chất thứ cấp thường qua ba bước cơ bản: [31]
Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi trường thạch mềm rồi được cấy chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy (nuôi cấy dịch huyền phù). Đây là giai đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính chất quyết định thành công của quá trình nuôi cấy tế bào. [31]
Khi tìm được điều kiện thích hợp, các nhà khoa học có thể phát triển quy mô nuôi cấy trên hệ thống bình nuôi cấy sinh học- bioreactor có dung tích khác nhau. Sau khi nghiên cứu thành công quy trình nuôi cấy tế bào trong phòng thí nghiệm, tiếp tục triển khai các phòng sinh khối tế bào thực vật. Từ đó sử dụng các kỹ thuật chiết tách để thu nhận các hợp chất cần thiết. [40], [53], [75], [122]
* Thuận lợi của việc sản xuất sản phẩm chuyển hóa thứ cấp bằng nuôi cấy mô, tế bào thực vật: [96]
- Điều kiện nuôi cấy (hóa hoạc và vật lý) có thể được kiểm soát và tối ưu hóa cho việc sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp.
- Tế bào có thể được chọn lọc và cải thiện bằng cách nhân dòng, gây đột biến hoặc biệt hóa bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp sinh học (kỹ thuật gen).
- Với những hệ thống đã biết có thể dễ dàng nghiên cứu chuyển hóa các chất trong tế bào và cơ chế sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứu cấp.
27T
1.6.3. Một số phương pháp tăng hiệu quả sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô, tế bào27T [31], [122]
Chọn lọc dòng tế bào cho năng suất cao:chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, sau đó phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi. Với dòng tế bào của cây bát tiên Euphorbia milli sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp 7 lần lượng anthocyanin so với nuôi cấy tế bào bố mẹ. Yamada và Sato (Nhật) đã chọn lọc được một dòng tế bào của cây Coptis japonica, chiết tách lượng chất berberin đạt 1,2 g/l, có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần sau 3 tuần nuôi cấy.
Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy: các thông số hóa học, vật lý như thành
phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, ánh sáng… đều có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp. Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy.
Cung cấp tiền chất: bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Bổ sung phenylalanin khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây hoa xôn Salvia officinalis đã kích thích tạo ra acid rosmarinic, cung cấp acid ferulic trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy vanillin, hoặc bổ sung leucin làm tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy cây tía tô Perilla frutiscens.
Phương pháp gợi kích thích (elicitation): các chất kích kháng bảo vệ thực
vật – elicitor báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứcấp. Các elicitor có thể là các peptid, oligosaccharid, lipid, glycopeptid hay các ion kim loại nặng... Sử dụng các elicitor là phương thức để thu được các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Trong số các elicitor được biết đến nhiều nhất là jasmonat, được dùng để tăng hàm lượng taxol trong tế bào thông đỏ.
Cố định tế bào: phương pháp cố định tế bào giúp các tế bào tiếp xúc với nhau tạo thành khối tế bào lớn hơn, giúp làm tăng hiệu suất hợp chất. Cố định tế bào thường dùng alginate trong một hộp xốp đồng nhất, hoặc cố định tự nhiên cho tế bào phát triển thành cụm.
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Mẫu cấy
Vật liệu dùng thí nghiệm là lá cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ex vitro (từ vườn ươm của Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt – Lâm Đồng) và cuống lá cây sâm in vitro ở phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới.
2.1.2. Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404
Chủng A. tumefaciens LBA 4404 chứa hệ thống vector kép gồm plasmid pVDH396 dùng để chuyển gen vào mô sâm và helper plasmid pAL4404, được cung cấp bởi phòng Công Nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới.
2.1.2.1. Helper plasmid pAL4404
- Chứa các gen vir và gen kháng streptomycin.
- Gen kháng streptomycin dùng để chọn lọc vi khuẩn. Gen này mã hóa enzyme streptomycin phosphotransferase.
2.1.2.2. Plasmid pVDH396
Plasmid pVDH396 (do TS. Nguyễn Thị Thanh thiết kế) có kích thước 15.890 bp với các gen được thiết kế trong vùng T-DNA (hình 2.1, hình 2.2).
Hình 2.2. Vị trí của gen hpt, gen ipt, gen gusAtrong vùng T-DNA của plasmid pVDH396
(*: promoter Senescence– associated gene 12 từ Arabidopsis thaliana)
2.1.3. Enzyme cắt giới hạn
Enzyme giới hạn NcoI được sử dụng để cắt plasmid pVDH396 nhằm kiểm tra sự hiện diện của plasmid này trong vi khuẩn E.coli, trình tự nhận biết và vị trí cắt:
2.1.4. Mồi và thang chuẩn
2.1.4.1. Mồi
Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen ipt:
• Mồi ipt forward: 5’ TCGGTCCAACTTGCACAGGAA 3’ • Mồi ipt reverse: 5’ TACTCCTGAGCGATCCCAT 3’
Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen hpt:
• Mồi hpt forward: 5’ CGTCGTTCGAGAAGTTTC 3’ • Mồi hpt reverse: 3’ TACTTCTACACAGCCATC 5’
Bảng 2.1. Kích thước thang DNA chuẩn λ-HindIII Thứ tự vạch DNA Kích thước (bp) 1 23.130 2 9.416 3 6.557 4 4.361 5 2.322 6 2.027 7 564
Bảng 2.2. Kích thước thang DNA chuẩn 1 kb
Thứ tự vạch DNA Kích thước (bp) 1 10.000 2 8.000 3 6.000 4 5.000 5 4.000 6 3.000 7 2.500 8 2.000 9 1.500 10 1.000 11 750 12 500 13 250
2.1.5. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.1.5.1. Hóa chất
WizardP
R
P Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) với thành phần gồm có:
• Cell Resuspension Solution (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 100 µg/ml RnaseA, pH 7,5)
• Cell Lysis Solution (0,2 % NaOH và 1 % SDS)
• Neutralization Solution (1,32 M potassium acetate)
• Column Wash Solution (80 mM Potassium acetate; 8,3 mM Tris-HCl; pH 7,5; 40 µg EDTA, 55 % ethanol)
• Dung dịch đệm TE (1X) (10 mM Tris-HCl pH 7,5; 1 mM EDTA, thêm 70 ml ethanol 95 % để pha 120 ml dung dịch)
• WizardP
TM
P
Minipreps DNA Purification Resin
• WizardP
TM
P
Minicolumn và Syringe Barrels
b. Hóa chất dùng để tách chiết DNA nhiễm sắc thể từ thực vật
NaCl 5M Tris-HCl 1M EDTA 5M Isopropanol
Phenol/Chloroform 1:1
c. Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose
Agarose
Ethidium bromide 10 mg/ml Dung dịch nạp mẫu
Dung dịch đệm TBE (10X stock): • Tris base: 108 g/l
• Boric acid: 55 g/l • EDTA 0,5 M: 40 ml/l
• Nước lên thể tích 1 lít. Hấp vô trùng. Dung dịch đệm TAE (50X stock):
• Glacial acetic acid: 57,1 ml • EDTA 0,5 M; pH 8: 100 ml
• Nước lên thể tích 1 lit. Hấp vô trùng.
d. Hoá chất trong phản ứng PCR dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Dung dịch đệm PCR 10X: Primer 1 và primer 2 Mẫu DNA Nước Taq polymerase.
e. Dung dịch stock X-Gluc 0,02M
X-Gluc: 70 mg DMSO: 2ml Nước: 8ml Dung dịch thử X-Gluc Stock X-Gluc: 5 ml Dung dịch đệm NaPOR4R (pH 7): 10 ml EDTA 0,25 M (pH 7): 4 ml Triton 100 10%: 1 ml.
f. Hóa chất dùng trong nuôi cấy và chuyển gen
Hóa chất dùng trong nuôi cấy: chất điều hòa tăng trưởng thực vật NAA (1- naphthaleneacetic), BA, 2,4-D và TDZ (thidiazuron).
Hóa chất dùng trong chuyển gen:
• Acetosyringone: hòa tan trong cồn, lên thể tích bằng nước cất, lọc vô trùng.
• Cefotaxime tan: hòa trong nước cất, lọc vô trùng; có tính diệt vi khuẩn.