3.2. THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN
3.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen
Hygromycin có tính độc đối với tế bào thực vật lẫn tế bào động vật. Gen hpt
mã hóa enzyme hygromycin phosphotransferase có khả năng phosphoryl hóa hygromycin, làm mất hoạt tính của kháng sinh này. Do đó những tế bào được chuyển gen hptsẽ phát triển bình thường trong môi trường có hygromycin với nồng độ thích hợp.
Nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp sẽ được sử dụng để chọn lọc các dòng mô sẹo sau thí nghiệm xử lý chuyển gen. Tùy đối tượng mà hygromycin tác dụng chọn lọc với các nồng độ khác nhau, nếu nồng độ tác nhân này trong môi trường chọn lọc quá thấp thì kết quả chọn lọc không đáng tin cậy, nhưng nếu nồng độ quá cao sẽ làm chết cả các tế bào đã được chuyển gen.
Tiến hành nuôi cấy các mẫu mô sẹo trên môi trường S2 bổ sung hygromycin ở các nồng độ khác nhau (0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 mg/l). Sau 2 tuần, các mẫu thí nghiệm có biểu hiện tăng trưởng chậm và bắt đầu chuyển sang nâu hơn so với mẫu đối chứng (0 mg/l), đặc biệt là các mẫu thí nghiệm với nồng độ hygromycin cao (> 20 mg/l). Tiếp tục cấy chuyển và theo dõi sau 8 tuần, kết quả cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin ≥ 25 mg/l trở nên nâu và chết; còn đối với các mẫu thí nghiệm ở nồng độ hygromycin thấp hơn 25 mg/l, sau thời gian đầu tăng trưởng chậm có sự hình thành các cụm tế bào mới bắt đầu tăng sinh lại.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nồng độ hygromycin
Môi trường S2 có bổ sung hygromycin (mg/l)
Số mẫu sống
Sau 2 tuần Sau 4 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần
0 mg/l hygromycin 15 15 15 15 5 mg/l hygromycin 15 14 14 14 10 mg/l hygromycin 13 11 9 9 15 mg/l hygromycin 12 10 8 7 20 mg/l hygromycin 11 7 5 4 25 mg/l hygromycin 8 6 3 0 30 mg/l hygromycin 5 3 1 0 35 mg/l hygromycin 5 2 0 0 40 mg/l hygromycin 3 1 0 0
Một số nghiên cứu môi trường chọn lọc sau chuyển gen đối với các loài thuộc chi Panax thường sử dụng chất kháng sinh kanamycin hoặc hygromycin. Nồng độ kanamycin được sử dụng ở các loài này là 50 mg/l (Ananchanok Tirajoh et al., 1996), hygromycin với nồng độ chọn lọc khoảng 20 mg/l hoặc cao hơn. Tuy nhiên trong thí nghiệm này, nhận thấy ở nồng độ hygromycin ở giới hạn 25 mg/l thì các mô sẹo đã ngừng tăng trưởng và chết dần.
Như vậy, 25 mg/l được xem là nồng độ thích hợp cho sự chọn lọc mô sẹo sâm Ngọc Linh.
Hình 3.8. Kết quả thử hygromycin sau 8 tuần
3.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
3.2.2.1. Biến nạp plasmid vào E. coli; kiểm tra sự hiện diện của plasmid trong E. coli và tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dùng chuyển gen
Mục đích của các thí nghiệm này là tạo dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciensdùng để chuyển gen.
Vật liệu ban đầu là plasmid pVDH396 mang gen ipt. Trước hết, plasmid này được biến nạp vào vi khuẩn E. coli. Sau biến nạp, vi khuẩn E. coli được nuôi nhân, tách chiết plasmid. Plasmid tách chiết được đem kiểm tra kích thước bằng cách
dùng enzyme NcoI để cắt và chạy điện di trên gel. Kết quả điện di cho thấy kích thước plasmid khoảng 15,9 kb (hình 3.9) - phù hợp với kích thước plasmid dùng biến nạp.
Tiếp theo, plasmid (tách từ E. coli) được biến nạp vào vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Sản phẩm Agrobacterium tumefaciens biến nạp được nuôi cấy nhân dòng, tách chiết plasmid và thực hiện phản ứng PCR đối với gen ipt. Kết quả cho thấy có sự hiện diện của băng DNA khuếch đại với kích thước 615 bp (hình 3.10).
Như vậy, dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 tạo được đã chứa plasmid pVDH396 (mang gen đích ipt) và được sử dụng để chuyển gen vào mô sâm.