Auxin và cytokinin (tỷ lệ auxin/cytokinin) có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo chồi. Do đó, thí nghiệm nhằm xác định nghiệm thức NAA-BA thích hợp [nồng độ auxin (NAA) kết hợp với nồng cytokinin (BA)] lên sự tạo chồi từ mô sẹo sâm. Áp dụng nghiệm thức NAA-BA xác định được đối với tái sinh mô sẹo cuống lá.
Cách tiến hành
+ Các cụm mô sẹo (qua nuôi cấy trên môi trường MS có 1 mg/l 2,4-D + 0,2 mg/l TDZ) có kích thước khoảng 5 mm được đặt trên môi trường MS với 30 g/l đường sacrose, 9 g/l agar và bổ sung NAA và BA với các nồng độ khác nhau.
+ Mỗi nghiệm thức được thử nghiệm trên 5 mẫu, lặp lại 3 lần.
+ Theo dõi, so sánh trạng thái chồi và số lượng chồi trong mỗi nghiệm thức trong thời gian 12 tuần, cấy chuyển 2 tuần/lần.
+ Kết luận môi trường thích hợp dùng tái sinh chồi.
Bảng 2.4. Nồng độ NAA và BA cho thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo sâm Ngọc Linh
STT Môi trường NAA (mg/l) BA (mg/l)
1 C1 1,0 0,5 2 C2 1,0 1,0 3 C3 1,0 1,5 4 C4 2,0 0,5 5 C5 2,0 1,0 6 C6 2,0 1,5
2.2.2. Thí nghiệm chuyển gen
2.2.2.1. Khảo sát nồng độ hygromycin thích hợp cho thí nghiệm chuyển gen Mục đích
Xác định nồng độ kháng sinh hygromycin thích hợp (tối thiểu gây chết) để chọn lọc tế bào ở thí nghiệm chuyển gen.
Cách tiến hành
+ Nuôi các cụm mô sẹo lá (≈ 5 mm) trên môi trường S2 có bổ sung hygromycin với các nồng độ 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35 và 40 (mg/l). Mỗi nồng độ thực hiện với 5 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
+ Theo dõi trạng thái và số mô sẹo còn sống sau 8 tuần.
+ Kết luận nồng độ hygromycin thích hợp sử dụng cho thí nghiệm chuyển gen.
2.2.2.2. Chuyển gen vào mô sẹo sâm nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
a. Biến nạp plasmid vào E. coli, nuôi vi khuẩn và tách chiết plasmid a.1. Biến nạp plasmid vào E. coli
+ Biến nạp plasmid vào E. coli được thực hiện bằng phương pháp gây sốc nhiệt ở 42P
o
P
C trong 2 phút (Sambrook và cs., 1989).
a.2. Nuôi vi khuẩn và tách chiết plasmid E. coli biến nạp
Các bước thực hiện
- Nuôi lắc vi khuẩn trong môi trường dinh dưỡng LB qua đêm có bổ sung kháng sinh tương ứng kanamycin 100 mg/ml.
- Tách chiết plasmid vi khuẩn:
Sử dụng bộ kit tách chiết plasmid vi khuẩn: WizardP
R
PPlus SV Minipreps DNA Purification System (Promega); thực hiện các bước tách chiết như sau:
+ Ly tâm kết lắng tế bào vi khuẩn từ 3 – 5 ml huyền phù nuôi cấy lắc ở tốc độ 10.000 vòng trong 10 phút. Bỏ phần nổi (supernatant) và thấm khô ống chứa bằng cách úp ngược ống trên một tờ giấy thấm.
+ Huyền phù hóa hoàn toàn các tế bào kết lắng trong 300 µl dung dịch tái huyền phù (Cell Resuspension Solution). Chuyển huyền phù tế bào vào ống ly tâm nhỏ 1,5 ml.
+ Thêm 300 µl dung dịch tự phân tế bào (Cell Lysis Solution) và trộn đều bằng cách đảo ngược ống 4 lần. Huyền phù tế bào sẽ được làm sạch.
+ Thêm 300 µl dung dịch trung hòa (Neutralization Solution) và trộn đều bằng cách đảo ngược ống vài lần. Nếu dùng chuỗi EndA+, thêm 600 µl dung dịch trung
hòa, đảo trộn bằng cách lật ngược 4 lần, ủ hỗn hợp tự phân trong bồn ổn nhiệt trong 10 phút.
+ Ly tâm hỗn hợp tự phân ở 10.000 vòng trong 10 phút
a.3. Tinh sạch và bảo quản plasmid
Các bước thực hiện
+ Với mỗi Miniprep chuẩn bị một Wizard Minicolumn. Hút 1 ml dung dịch DNA Purification Resin cho vào xy-ranh. Cẩn thận hút dịch trong mỗi Miniprep (supernatant của phần tách chiết) và chuyển vào trong ống của Minicolumn/xy-ranh đã chứa sẵn chất sền sệt.
+ Gắn piston vào và đẩy nhẹ nhàng dịch chảy vào Minicolumn. Tháo xy-ranh khỏi cột và tháo piston khỏi xy-ranh, gắn ống của xy-ranh trở lại Minicolumn. Hút 2 ml dung dịch rửa cột (Column Wash Solution) sau khi đã thêm cồn vào ống xy- ranh, gắn piston vào và đẩy dịch rửa cột chảy qua Minicolumn.
+ Tháo xy-ranh và chuyển Minicolumn vào ống ly tâm nhỏ 1,5 ml. Ly tâm Minicolumn ở 10.000 vòng trong 2 phút bằng máy ly tâm nhỏ để làm khô.
+ Chuyển Minicolumn vào một ống ly tâm 1,5ml khác. Thêm 50µl dung dịch đệm TE vào Minicolumn và chờ trong 1 phút. Ly tâm 10.000 vòng trong máy ly tâm nhỏ trong 20 giây để thu nhận plasmid DNA.
+ Tháo và bỏ Minicolumn. DNA plasmid được giữ ở nhiệt độ - 20P
o
P
C.
b. Kiểm tra sự hiện diện của plasmid pVDH396 trong E. coli bằng phản ứng cắt bởi enzyme giới hạn NcoI
Plasmid sau tách chiết được xử lý với enzyme cắt giới hạn là NcoI. Điện di sản phẩm sau phản ứng cắt để kiểm tra kích thước của plasmid.
Hỗn hợp phản ứng như sau: + DNA plasmid: 20 µl + Buffer: 3 µl + Enzyme NcoI: 2 µl + BSA: 1 µl Tổng thể tích: 26 µl