cấy tạo mô sẹo (thông tin cá nhân); hơn nữa trước đây, tác giả Nguyễn Trung Thành và cs. (2007) đã thành công trong nghiên cứu tạo mô sẹo (từ rễ cây sâm Ngọc Linh 5 năm tuổi) qua sử dụng môi trường MS có 1 mg/l 2,4-D. Do vậy ở thí nghiệm này, chỉ một nghiệm thức nồng độ 2,4-D (1 mg/l) được bố trí.
Theo chúng tôi, mô sẹo là loại vật liệu có thể được sử dụng trong nghiên cứu theo nhiều hướng khác nhau như biến nạp gen, sản xuất hợp chất thứ cấp. Từ tế bào
mô sẹo, có thể chuyển sang dạng nuôi cấy tế bào huyền phù như tác giả Nguyễn Trung Thành và cs. (2006) đã thực hiện đối với sâm Triều Tiên và cũng từ mô sẹo có thể nghiên cứu tái sinh rễ bất định; sau đó nuôi nhân rễ bất định như công trình nghiên cứu của tác giả Dương Tấn Nhựt và cs. (2006), Nguyễn Trung Thành và cs. (2007). Ở lĩnh vực nghiên cứu biến nạp gen, mô sẹo là vật liệu thường được các nhà nghiên cứu biến nạp gen sử dụng do chồi tái sinh thường không bị trạng thái khảm (chimeric) nếu quá trình chọn lọc được thực hiện nghiêm ngặt. Gorpenchenko và cs.
(2006) đã thành công trong nghiên cứu hai kiểu tái sinh phôi (somatic embryogenesis) và tái sinh cơ quan (organogenesis) qua thực hiện biến nạp gen
rolC từ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes dùng vật liệu mô sẹo sâm Triều Tiên. Choi (2006) cũng đã thành công trong nghiên cứu biến nạp gen chỉ thị gusA, gen kháng kanamycin (nptII) vào vật liệu mô sẹo phôi hợp tử cây sâm Triều Tiên dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
Mô sẹo từ hai loại vật liệu nói trên đã được nhân lên trên cùng môi trường. Tuy nhiên, ở thời điểm bố trí thí nghiệm tiếp theo do mô sẹo lá có nhiều hơn nên chỉ loại mô này được sử dụng để nghiên cứu xây dựng môi trường thích hợp nhằm nhân nhanh sinh khối dùng cho nghiên cứu chuyển gen.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp 2,4-D và TDZ đến khả năng tăng sinh khối mô sẹo lá sâm
Các cụm mô sẹo từ mẫu lá có khối lượng khoảng 100 mg được sử dụng để khảo sát khả năng tăng sinh khối qua tác động của auxin 2,4-D và cytokinin TDZ ở các nồng độ khác nhau.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh
khối của mô sẹo sâm Ngọc Linh
STT Môi trường Trọng lượng tươi trung bình (mg)/mẫu
1 S1 493,8 ± 35,55P a z 2 S2 757,2 ± 42,36P c 3 S3 483,8 ± 32,95P a 4 S4 631,6 ± 35,73P b P 5 S5 613,4 ± 22,87P b 6 S6 526,0 ± 34,55P ab
Các chữ cái a, b, c trong một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).
Hình 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ lên khả năng tăng sinh mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 8 tuần
Theo lý thuyết, auxin có tác dụng mạnh lên sự kéo dài của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo, tạo các tế bào hay nhóm tế bào có khả năng sinh phôi do chúng ảnh hưởng lên tính hữu cực của tế bào và kích thích các phân chia không cân xứng. Do đó auxin đã được sử dụng với mục đích tạo và nhân nhanh mô sẹo. Thực tế cho thấy, trong nuôi cấy sâm Ngọc Linh nói riêng và các loài thuộc chi Panax nói chung, chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D trong nhóm auxin được xem là chất có tác dụng tốt lên sự hình thành và tăng sinh của mô sẹo.
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sự sinh trưởng của chồi in vitro. Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Tuy nhiên, tác dụng này sẽ không hiệu quả nếu vắng sự hiện diện của auxin. Do đó, sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là cần thiết cho quá trình hình thành, tăng sinh và phát sinh hình thái của mô sẹo. Trong nhóm cytokinin, TDZ (thidiazuron) là chất có hoạt tính sinh học mạnh. TDZ do Arndt và cs. (1976) tìm ra đầu tiên; TDZ không chỉ kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo mà còn được chứng minh có hoạt tính cytokinin cao hơn cả zeatin (Mok và cs., 1982), đặc biệt TDZ có tính kháng lại sự phân hủy bởi các chất oxi hóa cytokinin (Mok và cs., 1987) nên khá bền trong môi trường nuôi cấy mô.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng 2,4-D (thuộc nhóm auxin) và TDZ (thuộc nhóm cytokinin) để khảo sát ảnh hưởng của chúng lên sự tăng sinh của mô sẹo cũng như sự hình thành phôi soma. Kết quả cho thấy mô sẹo sâm đều tăng sinh khối trong cả 6 loại môi trường. Trong đó, sự tăng trưởng của mô sẹo trong môi trường S1 (trọng lượng tươi trung bình 493,8 mg/mẫu) và S3 (trọng lượng tươi trung bình 483,8 mg/mẫu), S4 (trọng lượng tươi trung bình 631,6 mg/mẫu) và S5 (trọng lượng tươi trung bình 613,4 mg/mẫu) là tương tự nhau, môi trường S2 (trọng lượng tươi trung bình 757,2 mg/mẫu) có sự khác biệt so với môi trường S6 (trọng lượng tươi trung bình 526,0 mg/mẫu). Thành phần môi trường S2 có 1 mg/l 2,4-D và 0,2 mg/l TDZ phù hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo. Kết quả này hoàn toàn giống với thí nghiệm của Nhut D.T. và cs. (2006).
Trong nuôi cấy mô các loài thuộc chi Panax, 2,4-D là chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng phổ biến vì có tác dụng tốt cho sự tăng sinh khối của mô sẹo. Ngoài ra, với việc bổ sung TDZ, mô sẹo tăng sinh nhanh, quá trình phát sinh và hình thành phôi soma diễn ra mạnh hơn (Proctor J.T.A. và cs., 1996). Sự kết hợp giữa 2,4-D và TDZ có thể dẫn đến phát sinh cơ quan sau 6 ngày nuôi cấy (Yancheva và cs., 2003). Trong thí nghiệm này, tỷ lệ mô sẹo hình thành phôi soma khá cao (>70%). Trạng thái mô ở các nghiệm thức môi trường không khác nhau
nhiều. Tuy nhiên, môi trường S2 là môi trường thích hợp nhất cho sự tăng sinh khối và hình thành phôi soma.
3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo lá sâm
Mỗi giai đoạn phát triển của tế bào sinh phôi cần sự kết hợp đặc biệt của các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ở các nồng độ thích hợp. Một môi trường thích hợp cho giai đoạn này có thể cản trở sự diễn tiến của các giai đoạn tiếp theo. Trong giai đoạn cảm ứng (giai đoạn tạo các tế bào sinh phôi trong mô sẹo, dịch treo) thì sự có mặt của auxin là cần thiết nhưng sự có mặt tiếp tục của nó lại trở nên bất lợi cho sự biệt hoá mô của phôi (giai đoạn tiến hoá phôi soma) và tái sinh chồi.
Bảng 3.2. Kết quả tái sinh chồi sâm Ngọc Linh sau 12 tuần
STT Môi trường Số lượng chồi TB/mẫu
Trạng thái chồi
1 C1 7,4 ± 1,63P
ab z
- Chồi không xanh tốt.
- Phát triển không đồng đều.
2 C2 12,7 ± 0,86P
c - Chồi xanh tốt.
- Phát triển tương đối đồng đều ở các mẫu, lá chồi xanh, to.
3 C3 10,8 ± 1,93P
bc
- Chồi xanh tốt. - Phát triển đồng đều.
4 C4 6,6 ± 0,68P
a - Chồi tương đối tốt. - Lá chồi yếu.
5 C5 5,2 ± 0,58P
a - Chồi không xanh, tốt.
- Số chồi ít, phát triển không đều.
6 C6 6,0 ± 1,18P
a
- Chồi không xanh tốt. - Số chồi ít, phát triển chậm.
Các chữ cái a, b, c trong một cột biểu thị sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo trắc nghiệm phân hạng Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).
Tỷ lệ và nồng độ kết hợp giữa cytokinin và auxin có ảnh hưởng quan trọng trong quá trình tái sinh chồi. Thông thường, trên môi trường có tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mẫu có xu hướng tạo chồi (Vanden và cộng sự, 1998).
Trong 6 nghiệm thức khảo sát hiệu quả tác dụng của sự kết hợp giữa auxin (NAA) và cytokinin (BA) trong hình thành chồi, tỷ lệ chồi ở các nghiệm thức có sự khác biệt. Các mẫu ở môi trường C5 có số chồi thấp nhất (trung bình 5,2 chồi/mẫu). Cả 3 môi trường C4, C5 và C6 đều có tỷ lệ chồi thấp và trạng thái chồi cũng không tốt, chồi tăng trưởng chậm. Môi trường C1 có 7,4 chồi/mẫu, nhưng chồi tăng trưởng chậm và một số mẫu dường như không tạo được chồi. Ở môi trường C1, nồng độ BA thấp (0,5 mg/l) và các môi trường C4, C5, C6 có nồng độ NAA cao (2 mg/l) nên không phù hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của chồi.
Môi trường C2 và môi trường C3 cho kết quả tốt nhất. Số lượng chồi nhiều (môi trường C2: 12,7 chồi/mẫu; môi trường C3: 10,8 chồi/ mẫu) (hình 3.3, 3.4) và
sự tăng trưởng của chồi trong 2 nghiệm thức này tốt hơn hẳn so với 4 nghiệm thức còn lại. Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu vì cả hai môi trường C2 và C3 có tỷ lệ auxin/cytokinin thấp hơn so với các môi trường C1, C4, C5 và C6. Trong đó, môi trường C2 tốt hơn cho sự tạo chồi nên sẽ được dùng để tái sinh sau chuyển gen.
Nghiên cứu sự tạo chồi in vitro,nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng, đặc biệt có hiệu quả cao khi kết hợp hai hay nhiều hợp chất. Khi nghiên cứu ở loài Vicia faba, Mutasim và Kazumi (1999) đã chứng minh được rằng với sự kết hợp giữa BA và TDZ, chồi được hình thành và phát triển tốt hơn hẳn so với tác dụng riêng lẻ của TDZ. Hay ở sâm Mỹ (Panax quingquefolium L.), sự kết hợp giữa 2,4-D và NAA cũng cho kết quả tạo chồi rất tốt (Ananchanok Tirajoh, 1996). Đối với sâm Ngọc Linh, sự phối hợp giữa NAA (1mg/l) và BA (1mg/l) được xem là thích hợp cho sự hình thành và phát triển chồi.
Hình 3.3. Chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần trên môi trường C1, C2, C3, C4, C5 và C6
Hình 3.4. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần
a, b. Môi trường C1
c, d. Môi trường C2
Hình 3.5. Cận cảnh chồi tái sinh từ mô sẹo sâm Ngọc Linh sau 12 tuần
g, h. Môi trường C4
i, j. Môi trường C5
Nghiên cứu sâu hơn về bản chất của con đường tái sinh cây (plant regeneration pathway), nhận thấy ở sâm Ngọc Linh sự hình thành mô có khả năng sinh phôi (embryogenic) nhiều hay ít từ mô sẹo lá và cuống lá trên môi trường có 2,4-D và TDZ với các nồng độ khác nhau theo thời gian nuôi cấy – theo dõi sau khoảng 3 – 6 tháng. Sự hình thành mô có khả năng sinh phôi/mô phôi đã tạo điều kiện thích hợp cho sự tái sinh chồi khi mô sẹo được cây chuyển sang môi trường có NAA và BA. Hình 3.6 dưới đây minh họa cơ bản quá trình tái sinh chồi thông qua phôi soma từ mô sẹo lá.