CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.6. Các kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu
2.2.6.1. Thử nghiệm in vivo
- Tiêu chuẩn lựa chọn: Những bệnh nhân đủ các tiêu chuẩn dưới đây
được tuyển chọn vào nhóm nghiên cứu
Đơn nhiễm với P. vivax xác định bằng kính hiển vi với MĐKST thể vơ tính > 250/µl;
Bệnh nhân ≥ 1 tuổi;
Nhiệt độ nách ≥ 37.5ºC và/hoặc có tiền sử sốt trong vịng 48 giờ trở lại đây;
Bệnh nhân hoặc người giám hộ hợp pháp (đối với trẻ em) đồng ý tham gia nghiên cứu, lấy mẫu và tái khám bằng văn bản.
- Tiêu chuẩn loại trừ: Những bệnh nhân có một trong những dấu hiệu
sau cần được loại ra khỏi nghiên cứu
Dấu hiệu hoặc triệu chứng của SR nặng/SRAT (theo phân loại của WHO; Phụ lục I);
Dấu hiệu hoặc triệu chứng của suy dinh dưỡng nặng, xác định bằng cân nặng theo tuổi ≤ 3 đơn vị của độ lệch chuẩn (NCHS/WHO, Phụ lục II);
Lam máu xác định nhiễm chủng KST Plasmodium khác (bao gồm cả nhiễm phối hợp);
Thiếu máu nặng, xác định bằng nồng độ hemoglobin (Hb) < 7g/dl ở người lớn và < 5g/dl ở trẻ em;
Tiền sử quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc được đánh giá; Đang mắc các bệnh gây sốt khác ngoài bệnh SR;
Tiền sử mắc hoặc đang điều trị các bệnh mãn tính (tim, thận, bệnh gan, hồng cầu hình liềm, HIV/AIDS);
Đang có thai (xác định bằng que thử thai) hoặc đang cho con bú; Thường xuyên sử dụng các thuốc SR có ảnh hưởng đến tác dụng của thuốc SR;
Đã sử dụng các thuốc điều trị SR trong vòng 3 ngày gần đây (phỏng vấn bệnh nhân).
- Phác đồ điều trị SR do P. vivax
Bệnh nhân trong tiêu chuẩn nghiên cứu được nhận đủ liều điều trị CQ với tổng liều 25mg bazơ CQ/kg trọng lượng cơ thể, liệu trình 3 ngày (Phụ lục III). Ngày bệnh nhân được thu nhận và uống liều thuốc CQ đầu tiên được gọi là ngày D0.
Tất cả các lần bệnh nhân uống CQ đều được giám sát. Bệnh nhân sẽ được theo dõi 60 phút sau khi uống thuốc để phát hiện các biến cố bất lợi hoặc nơn mửa. Nếu bệnh nhân có nơn trong vịng 30 phút sau khi uống thuốc sẽ được uống lặp lại đủ liều thuốc như ban đầu, bệnh nhân nơn trong vịng 31 - 60 phút sau khi uống thuốc sẽ uống lại nửa liều thuốc. Nếu bệnh nhân vẫn tiếp tục nôn, bệnh nhân sẽ bị loại khỏi nghiên cứu và được điều trị bằng phác đồ thay thế.
Thuốc điều trị thay thế là thuốc dùng theo phác đồ của Bộ y tế Việt Nam (dùng khi bệnh nhân không đáp ứng điều trị hoặc nôn quá nhiều)
Thuốc dùng đường uống: QN (30mg/kg/ngày) và clindamycine (15mg/kg/ngày) cho 7 ngày;
Thuốc dùng đường tiêm: Astesunat (4mg/kg/ngày) tối thiểu trong 24 giờ cho đến khi bệnh nhân có thể dùng thuốc theo đường uống. Sau đó bệnh nhân uống DHA-PQ trong 3 ngày.
Điều trị triệt để
Trừ khi tái phát P.vivax xảy ra trước ngày 42, điều trị PQ sẽ được cung cấp cho bệnh nhân vào ngày D42 và liều điều trị được thực hiện theo hướng dẫn quốc gia (0.25mg/kg/ngày x 14 ngày) nếu bệnh nhân có xét nghiệm âm tính với thiếu men G6PD.
Thuốc điều trị đồng thời
Bất kỳ loại thuốc mới nào được bệnh nhân uống bổ sung trong thời gian theo dõi 42 ngày vì bất kỳ lý do gì, đều phải được ghi trong mục các thuốc dùng đồng thời (ví dụ như thuốc kháng sinh điều trị nhiễm trùng, thuốc chống nôn vv…). Mỗi loại thuốc mới cần phải ghi một lần.
Đối với bệnh nhân ngừng thuốc thử nghiệm sớm hoặc những người không đáp ứng với thử nghiệm thuốc và được điều trị bằng thuốc SR khác, các thông tin này phải được ghi lại ngày bắt đầu và ngày kết thúc dùng thuốc trong mục các thuốc dùng đồng thời, mục “Thuốc điều trị sốt rét”.
Danh mục các thuốc cần phải tránh khi điều trị thuốc SR (Phụ lục IV).
-Theo dõi bệnh nhân thử nghiệm lâm sàng
Từ ngày D0 cho đến khi sạch KST
Sau khi bệnh nhân được lấy 5mL máu tĩnh mạch, uống liều thuốc CQ đầu tiên và được theo dõi trong vòng 1 giờ, bệnh nhân sẽ được theo dõi 12 giờ một lần bằng lam máu cho đến ngày thứ 3 hoặc lâu hơn (nếu cần thiết) cho đến khi sạch KST thể hiện bằng hai lam máu liên tiếp âm tính.
Mỗi ngày tái khám, bệnh nhân được phỏng vấn và khám lâm sàng lấy các mẫu máu đầu ngón tay (giọt mỏng và giọt dày), nhuộm Giemsa và soi kính hiển vi để phát hiện KST và đếm mật độ.
Ngày 7, 14, 21, 28, 35, 42
Vào những ngày theo dõi bệnh nhân được yêu cầu quay lại trạm y tế khám hoặc nhân viên y tế đến khám tại nhà, bệnh nhân sẽ được phỏng vấn và khám lâm sàng, thu thập mẫu máu đầu ngón tay (giọt mỏng và giọt dày),
nhuộm Giemsa và soi kính hiển vi để phát hiện KST và mật độ.
Bệnh nhân được yêu cầu quay lại trạm y tế khám vào bất kỳ thời gian nào trong thời gian theo dõi nếu có bất kỳ dấu hiệu nào của bệnh SR (ví dụ: sốt, đau đầu…) hoặc có bất kỳ dấu hiệu nào của bệnh như sốt, xuất hiện các dấu hiệu nguy hiểm (không uống được hoặc không bú được, nôn mửa nặng, co giật, hôn mê bất tỉnh, khơng có khả năng đứng, ngồi, khó thở) hoặc trong trường hợp mắc các bệnh khác.
Quy trình xét nghiệm và đánh giá
Soi kính hiển vi
Lam máu được lấy tại thời điểm sàng lọc, tiêu bản được nhuộm nhanh (10% Giemsa trong 15 phút) để xác định sự có mặt của thể tư dưỡng P. vivax với MĐKST ≥ 250 KST/µl. Các lam máu của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu và các ngày theo dõi được nhuộm với nồng độ Giemsa 3% trong 45 phút. Các lam máu được soi tại vật kính dầu có độ phóng đại 100x.
Nhiễm phối hợp: 100 vi trường của tiêu bản giọt đặc được đếm để loại
trừ nhiễm phối hợp. Trong trường hợp nghi ngờ, tiêu bản giọt mỏng được sử dụng để xác nhận. Nếu các lam máu của ngày theo dõi khơng có sự hiện diện của nhiễm phối hợp, bệnh nhân sẽ được giữ lại để theo dõi.
MĐKST: được xác định bằng số lượng KST đếm được trên 200 bạch cầu
đếm trên máy đếm tay. MĐKST là số lượng KST thể vơ tính/µl máu, được tính dựa trên số lượng KST thể vơ tính trên số lượng bạch cầu đếm được và được hiệu chỉnh dựa trên số lượng bạch cầu ước tính (8.000 bạch cầu/µl máu).
Số lượng KSTSR đếm được x 8.000 MĐKSTSR/µl =
Số lượng bạch cầu đếm được. Trong đó, 8.000 là số lượng bạch cầu ước tính.
Khi số lượng KST thể vơ tính đếm được nhỏ hơn 10 trên 200 bạch cầu trên lam máu theo dõi, số lượng KST phải được tiếp tục đếm cho đến khi số lượng bạch cầu đạt được ít nhất là 500 bạch cầu (vi trường đầy đủ mà tại đó
500 bạch cầu được đếm). Lam máu được coi là âm tính khi số lượng bạch cầu đếm được là 1.000 mà khơng có sự hiện diện của KST thể vơ tính.
Thể tư dưỡng: Số lượng KST thể tư dưỡng được đếm ở tất cả các lam
máu dương tính từ ngày D0 và vào ngày KST xuất hiện trở lại so với 200 bạch cầu trên mỗi lam máu. Chỉ những bệnh nhân nào có MĐKST thể nhẫn non đạt từ ˃ 65% trở lên mới được đưa vào nuôi cấy đánh giá sự nhạy cảm của KST với thuốc.
Giao bào: số lượng giao bào được tính dựa trên số lượng giao bào
đếm được trên 500 bạch cầu.
Tất cả các lam máu phải được đọc bởi hai kỹ thuật viên có kinh nghiệm theo phương pháp mù đơi để xác định thời gian sạch KST. Trong trường hợp kết quả soi lam không phù hợp (khác nhau về kết quả chủng KST, MĐKST sai khác hơn 25%), lam máu phải được đọc lại bởi kỹ thuật viên thứ ba. Kết quả cuối cùng của MĐKST được tính bằng trung bình cộng của hai kết quả gần nhau nhất.
Nồng độ Heamoglobin: 5µl máu toàn phần được lấy vào cuvette,
nồng độ heamoglobin được đo bằng máy Hemocue vào ngày D0.
2.2.6.2. Thử nghiệm in vitro
Các mẫu máu nhiễm P.vivax đơn thuần có MĐKST thể nhẫn non > 65% được đưa vào nuôi cấy đánh giá sự nhạy cảm của KST với thuốc SR [49].
-Chuẩn bị phiến nhựa gắn thuốc
Các phiến nhựa được gắn các thuốc SR với các nồng độ thuốc khác nhau theo nguyên tắc giảm ½ nồng độ. Giếng A có nồng độ thuốc cao nhất, giếng G có nồng độ thuốc thấp nhất, giếng H là giếng chứng (khơng có thuốc):
Nồng độ của thuốc QN là: (A)1.600 nM/L (B)800 nM/L (C)400 nM/L
(D)200 nM/L
(E)100 nM/L
(F)50 nM/L
Nồng độ thuốc DHA là: (A)32,0 nM/L (B)16,0 nM/L (C)8,0 nM/L (D)4,0 nM/L (E)2,0 nM/L (F)1,0 nM/L (G)0,5 nM/L; Nồng độ thuốc CQ là: (A)800 nM/L (B)400 nM/L (C)200 nM/L (D)100 nM/L (E)50 nM/L (F)25 nM/L (G)12,5 nM/L; Nồng độ thuốc PQ là: (A)400 nM/L (B)200 nM/L (C)100 nM/L (D)50 nM/L (E)25 nM/L (F)12,5 nM/L (G)6,25 nM/L. P. vivax QN DHA CQ PQ QN DHA CQ PQ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Cao A A A A A A A A B B B B B B B B C C C C C C C C D D D D D D D D E E E E E E E E F F F F F F F F Thấp G G G G G G G G Giếng H H H H H H H H chứng
Hình 2. Sơ đồ nồng độ thuốc gắn trên phiến nhựa 96 giếng
Các phiến nhựa đã gắn thuốc được bảo quản ở 2 - 8oC, bọc kín bằng giấy bạc.
-Chuẩn bị hóa chất, môi trường, nguyên vật liệu trước nuôi cấy
Các dung dịch dùng cho nuôi cấy được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh và huyết thanh bảo quản tại ngăn đá được lấy ra cho vào tủ ấm 37oC để rã đơng hồn tồn rồi chuyển ra tủ an toàn sinh học. Lấy 5,6mL dung dịch McCoy 2,8µl dung dịch Gentamycin, 56µl dung dịch Glucose 20%, 1,4mL dung dịch huyết thanh AB cho vào ống Falcon 15mL, trộn đều để được môi
trường nuôi cấy (BMM), chuyển BMM vào tủ ấm 37oC ít nhất 30 phút trước khi thử nghiệm.
Lấy phiến nhựa đã được gắn ra khỏi ngăn mát tủ lạnh và đưa vào tủ ấm 37oC trong vòng 30 phút trước khi thử nghiệm.
-Quy trình tiến hành thử thuốc
Lấy 5 mL máu tĩnh mạch cho vào ống hút chân khơng có chứa sẵn chất chống đơng, ly tâm 1.800 vịng trong 10 phút, hút bỏ phần huyết tương và lớp bạch cầu. Sau đó thêm 3 thể tích Phosphate Buffer Saline (PBS) vào cặn hồng cầu nhiễm (iRBC) để được hỗn dịch có nồng độ Hematocrit (HCT) là 25%.
Chuyển hỗn dịch iRBC có HCT 25% ở trên vào cột lọc cellulose để lọc bạch cầu. Sau khi lọc xong ly tâm 1.800 vòng trong 5 phút. Hút bỏ dịch nổi đến khi thể tích dịch nổi bằng thể tích iRBC để thu được hỗn dịch có HCT 50%. Xác nhận q trình lọc bạch cầu thành cơng bằng cách kiểm tra lam máu dưới kính hiển vi tại vật kính 100x.
Mơi trường và phiến nhựa gắn thuốc được lấy từ tủ ấm được cho ra tủ an tồn sinh học. Chuyển 300μl iRBC có HCT 50% vào ống falcol 15mL ly tâm 1.800 vòng trong 5 phút loại bỏ dịch nổi, thêm 7mL BMM đã được làm ấm để có HCT 2%. Trộn đều, cho vào máng nhựa vô trùng, dùng pipette đa kênh hút 200µl hỗn dịch trên vào cho mỗi dãy thuốc giếng cần thử, hỗn dịch cịn lại cho 200µl hỗn dịch cho vào mỗi giếng (x 4 giếng) không gắn thuốc để làm giếng thăm dò thể phân liệt và làm lam máu 0 giờ, ghi các thông tin: mã bệnh nhân, ngày, giờ, chủng KST trên nắp phiến nhựa. Phiến nhựa được đặt trong bình nến và ủ trong tủ ấm ở 37ºC. Sau 24 giờ, kiểm tra số lượng thể phân liệt trong giếng chứng bằng cách lấy 50μl hỗn dịch từ giếng chứng chuyển vào ống 1.5mL, ly tâm nhanh, loại bỏ dịch nổi. Lấy lam máu, cố định và nhuộm với Giemsa 10% trong vòng 15 phút. Đếm số lượng thể phân liệt trên 200 iRBC. Lấy lam máu ở các giếng chứng sau 34 giờ và sau đó mỗi 2 - 4 giờ cho đến khi số lượng thể phân liệt trên 200 iRBC đạt tới 40% (> 80 thể
phân liệt /200 iRBC) [49]. Khi tỷ lệ thể phân liệt đạt > 40% trong khoảng thời gian 34 giờ đến 48 giờ nuôi cấy được dừng lại.
Chú ý: Thời gian nuôi cấy tối đa là 48 giờ. Các mẫu nuôi cấy không đạt
tới 40% thể phân liệt trong vịng 48 giờ được coi là ni cấy khơng thành cơng.
Ngồi tủ an tồn sinh học để các phiến nhựa nghiêng 45o trên 5 phút, nhẹ nhàng hút bỏ dịch nổi. Lấy lam máu cho mỗi nồng độ thuốc. Ghi nhãn với mã bệnh nhân, nồng độ thuốc, thời gian thu hoạch. Nhuộm Giemsa như đã mô tả ở trên cho mỗi lam máu, đếm số lượng thể phân liệt /200 iRBC. Ghi kết quả đếm lam vào biểu mẫu.
Tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt được tính như sau:
Tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể Số thể phân liệt tại giếng có thuốc x 100 =
phân liệt Số thể phân liệt tại giếng chứng
IC50 sẽ được tính tốn bằng cách sử dụng phần mềm phân tích và phương pháp báo cáo (IVART) được phát triển trực tuyến bởi WWARN [51].