Các mẫu rong biển được thu thập dựa vào quy phạm tạm thời điều tra tổng hợp biển của Uỷ ban Khoa học và Kĩ thuật Nhà nước (phần rong biển), ban hành năm 1980 cho các mẫu thu ở vùng triều. Các mẫu thu ở vùng dưới triều dựa vào tài liệu hướng dẫn của Wilkinson & Baker 1997 [39,40].
Mẫu nghiên cứu sinh - hóa, được rửa sạch bằng nước mặn sau đó rửa bằng nước ngọt và bảo quản bằng tủ lạnh sâu ở -20 oC, mẫu làm tiêu bản được ngâm trong dung dịch formol 5%, mẫu tiêu bản khổ được đặt trên giấy croki sau đó ép trong giấy thấm.
1350 lần). Việc phân loại rong biển tuân theo nguyên tắc chung phân loại thực vật theo các nghiên cứu trước đây [41-46].
2.3.2. Xác định độ ẩm của mẫu
Độ ẩm của mẫu được xác định theo dược điển IV, Phụ lục 9.6 mất khối lượng do làm khô [47].
Thực nghiệm: Sấy khô đĩa petri và nắp ở nhiệt độ 105±2 oC đến khối lượng không đổi m0, cân 10g ± 0,01g mẫu trên đĩa đã sấy (m1). Đem mẫu và đĩa sấy ở 105±2oC cho đến khối lượng không đổi trong khoảng 4h. Tiếp tục sấy khô cho đến khi khối lượng giữa 2 lần sấy không vượt quá 0,01g. Sau khi sấy lấy nắp đậy đĩa lại và chuyển qua bình hút ẩm để làm nguội và cân ghi khối lượng là (m2). Hàm lượng ẩm của mẫu được tính như sau:
Trong đó: m0: khối lượng nắp và đĩa (g) m1: khối lượng nắp + đĩa + mẫu (g)
m2: khối lượng nắp + đĩa + mẫu sau khi sấy khô (g) 2.3.3. Xác định hàm lượng tro toàn phần
Hàm lượng tro toàn phần được xác định theo dược điển IV, Phụ lục 9.8 [47]. Thực nghiệm: Cân 5g mẫu chính xác tới 0,01g vào chén nung bằng sứ có nắp đã sấy đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng. Đậy nắp chén nung và đốt sơ bộ trên bếp điện. Sau khi mẫu đã cháy thành than, chuyển chén nung chứa mẫu sang lò nung ở nhiệt độ 600- 700oC. Mẫu được tro hóa tới màu trắng xám hoặc vàng nhẹ, lấy kẹp gắp chén nung đặt trong bình hút ẩm khoảng 40-60 phút, cần xác định khối lượng chén nung chứa tro của mẫu chính xác tới 0,01g.
Tính kết quả: hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính bằng công thức:
0 1 1 ( - G) x 100 ( - G) = G X G
Trong đó:
G0: Khối lượng của chén (g)
G1: Khối lượng của chén + Khối lượng của mẫu thử (g)
G2: Khối lượng của chén + Khối lượng tro trắng sau khi đã nung (g). 2.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số
Xác định hàm lượng protein tổng số được thực hiện theo phương pháp Kjeldahl 1883 [48].
Thực nghiệm: Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 0,01mg chuyển vào bình Kjeldahl khô. Thêm 10g hỗn hợp xúc tác vào trộn đều sau đó bổ sung 20 ml acid sulfuric 98%, xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng mẫu chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 phút. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl. Để nguội dịch phân hủy (dịch A). Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng acid dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.
Pha loãng dịch A với 250 ml nước cất và thêm từ từ khoảng 70 ml dung dịch natri hydroxit để tạo thành hai lớp rõ rệt. Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch acid boric. Chưng cất amoniac vào lượng dư acid boric nồng độ 20 g/lít (khoảng 25 ml), có chứa 0,5 ml chất chỉ thị. Lấy khoảng 180 ml dịch chưng cất và chuẩn độ amoniac bằng dung dịch acid chuẩn độ. Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang màu xám.
Hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (1):
(1)
Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (2):
(2) Trong đó:
V là thể tích dung dịch acid chuẩn độ cần để trung hòa amoniac sau khi trừ giá trị tương ứng của mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);
0,0014 là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch acid chuẩn độ (acid clohydric 0,1 M hoặc acid sulfuric 0,05 M);
M là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
W là độ ẩm của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, xác định được theo TCVN 10788:2015.
Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Công thức (3):
XP1 = XN1 x 6,25 (3)
Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (4):
XP2 = XN2 x 6,25 (4) Trong đó:
XN1 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (1);
XN2 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng chất khô, theo Công thức (2);
6,25 là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng protein. ( 1) V x 0.0014 V x 0.14 x 100 = = N X m m ( 2) V x 0.0014 100 V x 14 x x 100= 100 w x (100-w) = - N X m m
2.3.5. Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate
Phương pháp acid phenol – sulfuric là phương pháp xác định nồng độ carbohydrate [49].
Nguyên tắc: Dùng acid sunfuric đặc để khử nước, tạo ra các dẫn xuất furfural. Phản ứng tiếp theo giữa các dẫn xuất furfural và phenol tạo ra màu có thể tách rời.
Tiến hành: Lấy 1g mẫu trộn với 2 ml dung dịch phenol 5% trong một ống nghiệm. Tiếp theo ta thêm nhanh 5 ml acid sulfuric đặc. Để ống nghiệm yên trong 10 phút, tiếp theo lắc nhẹ trong 30s và được đặt trong nồi cách thủy ở nhiệt độ phòng 20 phút để màu phát triển. Sau đó, lấy dung dịch đo trên máy quang phổ ở bước sóng 490 nm. Các dung dịch đối chiếu được chuẩn bị theo cách tương tự như trên nhưng thay 2 ml dung dịch carbohydrate bằng dung dịch milipore. Phenol được sử dụng trong quy trình này đã được chưng cất lại và 5% phenol trong nước (w/w) đã được chuẩn bị ngay trước khi đo. 2.3.6. Phương pháp chiết lipid tổng
Các mẫu rong biển được chiết lipid tổng theo phương pháp của Bligh and Dyer (1959) [50]. Đây là phương pháp thường quy được sử dụng cho mẫu biển tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam (sơ đồ hình 2.1).
Thực nghiệm: 50g mẫu tươi được xay hoặc cắt nhỏ, chiết với 150ml hỗn hợp dung môi CHCl3/CH3OH, kết hợp siêu âm ở 400C trong 2 giờ. Toàn bộ dịch chiết được lọc ra, phần bã được chiết lại một lần nữa với 150ml CHCl3. Dịch chiết của 2 lần được gộp lại và bổ sung thêm 100ml H2O, lắc mạnh, sau đó để lắng đến khi toàn bộ hỗn hợp dịch chiết được phân thành hai lớp. Pha dưới chứa lipid tổng được chiết ra, làm khan bằng Na2SO4, lọc bỏ muối, dịch chiết được cô quay loại bỏ dung môi. Hàm lượng lipid tổng tính theo phần trăm so với lượng mẫu ban đầu đem chiết. Lipid tổng được bảo quản trong CHCl3 tinh khiết ở nhiệt độ -20oC.
Sơ đồ 2.1. Thực nghiệm chiết lipid tổng
2.3.7. Phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid
Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid được phân tích và xác định trên bản mỏng tráng sẵn (6cm × 6cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga). Dịch chiết lipid tổng được thổi kiệt dung môi bằng khí argon, bổ sung CHCl3 phân tích (nồng độ 10 mg/ml), chấm điều chế trên bản mỏng 3 vệt theo nồng độ tăng dần. Cho bản mỏng chạy triển khai trong hệ dung môi C6H14:(CH3CH2)2O:CH3COOH, để khô sau đó cho chạy lần 2 trong hệ CHCl3:MeOH/40:60. Sử dụng thuốc thử H2SO410%/MeOH, sấy bản mỏng ở 110-220oC. Scan trên máy Epson perfection 2400 PHOTO với độ phân giải và kích thước tiêu chuẩn. Phần trăm của các lớp chất trong lipid tổng được xác định dựa trên sự đo diện tích và cường độ màu trong chương trình phân tích hình ảnh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, LB Nga [51].
Mẫu rong (50g) Chiết, làm khan bằng Na2SO4, Quay cất 150ml CHCl3, siêu âm 2h, lọc Xay nhỏ, 150ml CHCl3/CH3OH 2/1 Siêu âm 40oC, 2h Hỗn hợp dung dịch phân lớp Lipid tổng
Bã rong sau chiết
Dung dịch 1
Dung dịch 2
Lọc
Sơ đồ 2.2. Thực nghiệm phân tích thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid
2.3.8. Phương pháp xác định thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid tổng lipid tổng
Mẫu lipid tổng được metyl este hoá theo phương pháp của Carreau & Dubacq (1978) [33].
Thực nghiệm: 10mg lipid tổng đưa vào lọ vial 4ml và bổ sung 2ml hỗn
hợp tác nhân H2SO4 2%/MeOH. Sau khi phản ứng hoàn toàn, hỗn hợp được bổ sung thêm 1ml n-hexan và 100µl H2O, lắc kỹ và phân lớp bằng máy ly tâm (3000 vòng/phút). Hút phân lớp phía trên, sau đó bổ sung thêm 1ml n-hexan, ly tâm và hút kiệt phân lớp phía trên. Gộp các phần đem cô kiệt dung môi và bổ sung 100µl CHCl3 tinh khiết, làm sạch bằng sắc ký lớp mỏng điều chế, giải hấp bằng CHCl3, loại bỏ dung môi, thu được phần metyl este (ME) của các acid béo. Thành phần acid béo được phân tích bằng máy GC và GC-MS. Phương pháp phân tích acid béo theo tiêu chuẩn ISO/FDIS 5590:1998, Liên
Hòa tan trong CHCl3 chuẩn hóa nồng độ, đưa chất lên bản mỏng Kết quả hàm lượng các lớp chất Bản mỏng Sorbfil Bản mỏng đã triển khai Epson scan 2400 photo
Hiện hình với H2SO4 10%/MeOH, 130÷ 210oC Sử dụng phần mềm tính toán Sorbfil
Lipid tổng (50mg)
SK bản mỏng Hexan:Dietylete:Axidacetic chạy bản mỏng với hệ CHCl3 : MeOH
acid béo được xác định bằng GC-MS với thư viện phổ chuẩn NIST 11 để so sánh.
2.3.9. Phương pháp xác định dạng phân tử và cấu trúc của các hợp chất
Dạng phân tử của các phân lớp lipid phân cực của các mẫu rong biển được phân tích bằng phương pháp phổ khối phân giải cao trên thiết bị Shimadzu LCMS-IT-TOF, do hãng Shimadzu (Kyoto, Nhật Bản) cung cấp. Việc phân tích được tiến hành tại Trung tâm Khoa học Quốc gia về sinh vật biển – Phân viện Viễn Đông – Viện Hàn lâm Khoa học Liên Bang Nga [32,33]. Phương pháp và các dữ liệu phổ khối của glycolipid được xác định như sau:
2.3.9.1. Dạng phân tử monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) CTPT: CxHyO10
CTCT: Dạng diacyl của phân tử MGDG
Đầu phân cực MGDG chứa gốc monogalactosyl (-C6H11O6). Tùy thuộc vào cấu tạo của đuôi không phân cực, MGDG được chia thành 3 loại: diacyl, ankyl acyl, ankenyl acyl. Để xác định dạng phân tử của MGDG căn cứ vào 5 dấu hiệu:
(i) Thời gian lưu dự kiến: (2,5 - 3,5) ±n phút.
(ii) Trên môi trường điện trường 3, xuất hiện các ion âm [M-H] và dạng adduct [M+HCOO]- với m/z là số lẻ.
(iii) Trên môi trường điện trường 1, xuất hiện ion dương [M+Na]+ với cường độ peak lớn và ion [M+NH4]+ với cường độ peak không lớn nên với những phân tử MGDG có hàm lượng ít thì không xuất hiện
(iv) Khối lượng phân tử tùy thuộc vào cấu tạo của đuôi không phân cực, thường nằm trong khoảng m/z 700 - 900.
(v) Công thức phân tử tương ứng có dạng -O10 hoặc -O9.
+ Loài rong lục Halimeda incrasata: có 12 dạng phân tử MGDG (có 3
dạng là đồng phân) xác định theo giá trị khối lượng tăng dần và thời gian lưu: Rt 3,11: MGDG 30:2; MS- m/z 721,4803 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 467,35 và 254,1303 (16:1). Rt 2,92: MGDG 30:0; MS- m/z 725,5144 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 497,31 (228,2044 (14:0)) và 469,28 (256,2344 (16:0)). Rt 3,14: MGDG 32:4; MS- m/z 745,4813 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 495,31 (250,1713 (16:3)), 491,27 (254,2113 (16:1)) và 467,27 (278,2113 (18:3). Rt 2,96: MGDG 32:2; MS- m/z 749,5127 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 521,28 (228,2327 (14:0)), 495,3 (254,2127 (16:1)) và 469,27 (280,2427 (18:2). Rt 2,78: MGDG 32:0; MS- m/z 753,554 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 497,31 (256,244 (16:0)). Rt 3,21: MGDG 34:6; MS- m/z 769,4804 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 491,25 (278,2304 (18:3)). Rt 3,08: MGDG 34:5; MS- m/z 771,4951 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 521,23 (250,1851 (16:3)) và 491,26 (280,2351 (18:2)). Rt 2,91: MGDG 34:3; MS- m/z 775,524 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 521,29 (254,234 (16:1)) và 495,28 (280,244 (18:2)). Rt 2,81: MGDG 36:4; MS- m/z 801,5442 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 545,31 (256,2342 (16:0)) và 497,31 (304,2342 (20:4)). 2.3.9.2. Dạng phân tử digalactosyldiacylglycerol (DGDG) CTPT: CxHyO15
Đầu phân cực DGDG chứa gốc digalactosyl (-C12H21O11). Tùy thuộc vào cấu tạo của đuôi không phân cực, DGDG được chia thành 3 loại: diacyl, ankyl acyl, ankenyl acyl. Để xác định dạng phân tử của DGDG căn cứ vào 5 dấu hiệu:
(i) Thời gian lưu dự kiến: (8,5 - 14) ± n phút.
(ii) Trên môi trường điện trường 3, xuất hiện các ion âm [M-H] với m/z là số lẻ và dạng adduct [M+HCOO]- có cường độ peak không lớn nên không thấy xuất hiện với hàm lượng thấp.
(iii) Trên môi trường điện trường 1, xuất hiện ion dương [M+Na]+ có cường độ peak lớn nhất với m/z là số lẻ và ion [M+NH4]+ có cường độ peak không lớn nên với những phân tử DGDG có hàm lượng ít thì không xuất hiện.
(iv) Khối lượng phân tử tùy thuộc vào cấu tạo của đuôi không phân cực, thường nằm trong khoảng m/z 850 - 1000.
(v) Công thức phân tử tương ứng có dạng -O15 hoặc -O14.
+ Loài rong lục Halimeda incrasata: có 11 dạng phân tử DGDG trong đó có 3 đồng phân xác định theo giá trị khối lượng tăng dần và thời gian lưu:
Rt 10,34: DGDG 30:0; MS- m/z 887,5625 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 659,36 (228,2025 (14:0)), 631,32 (256,2425 (16:0)), 497,31, 469,27 và 405,15. Rt 10,58: DGDG 32:2; MS- m/z 911,5639 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 683,35 (228,2139 (14:0)), 631,32 (280,2439 (18:2)), 469,26 và 405,12. Rt 10,04: DGDG 32:1; MS- m/z 913,5801 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 659,34 (228,2001 (14:0)), 659,34 (254,2401 (16:1)), 657,32 (256,2601 (16:0)), 631,32 (282,2601 (18:1)), 523,33, 497,31, 469,27 và 347,09. Rt 9,51: DGDG 32:0; MS- m/z 915,598 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 687,39 (228,208 (14:0)), 659,34 (256,248 (16:0)), 657,32 (256,2601 (16:0)), 631,32 (284,278 (18:0)), 497,3, 469,29, 405,14 và 347,09. Rt 9,71: DGDG 34:2; MS- m/z 939,5965 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 683,35 (256,2465 (16:0)), 659,35 (280,2465 (18:2)), 521,32, 497,31, 405,14 và 347,09. Rt 9,23: DGDG 34:1; MS- m/z 941,6083 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 685,37 (256,2383 (16:0)), 659,35 (282,2583 (18:1)), 523,31, 497,31, 405,15.
Rt 8,78: DGDG 34:0; MS- m/z 943,6282 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 687,38 (256,2482 (16:0)), 659,36 (284,2682 (18:0)), 525,32, 497,3, 405,14, 347,09. Rt 8,57: DGDG 36:1; MS- m/z 969,6405 [M+Na]+; MS2- [M+Na]+ m/z 713,4 (256,2405 (16:0)), 685,37 (284,2705 (18:0)), 659,37, 497,28. 2.3.9.3. Dạng phân tử sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) CTPT: CxHyO12S
CTCT: Dạng diacyl của phân tử SQDG
Đầu phân cực SQDG chứa gốc sulfoquinovosyl (-C6H11O8S). Tùy thuộc vào cấu tạo của đuôi không phân cực, SQDG được chia thành 3 loại: diacyl, ankyl acyl, ankenyl acyl. Để xác định dạng phân tử của SQDG căn cứ vào 5 dấu hiệu:
(i) Thời gian lưu dự kiến: (10 - 16)±n phút.
ii) Trên môi trường điện trường 3 xuất hiện ion âm [M-H] , theo quy tắc nitrogen, m/z của ion này là số lẻ.
(iii) Trên môi trường điện trường 1, không có ion dương [M+H]+ và dạng adduct [M+Na]+.
(iv) Khối lượng phân tử tùy thuộc vào cấu tạo của đuôi không phân cực, thường nằm trong khoảng m/z 700 - 950.
(v) Công thức phân tử tương ứng có dạng -O12S hoặc -O11S.
+ Loài rong lục Halimeda incrasata: có 17 dạng phân tử SQDG xác
định theo giá trị khối lượng tăng dần và thời gian lưu:
Rt 14,99 : SQDG 28:0; MS- m/z 737,4434 [M-H] ; MS2- m/z 509,24 (14:0).
Rt 14,69: SQDG 30:1; MS- m/z 763,4582 [M-H] ; MS2- m/z 509,2511 (14:0). Rt 14,09: SQDG 30:0; MS- m/z 765,4663 [M-H] ; MS2- m/z 509,24 (14:0), 537,2709 (16:0), 283,04, 255,23 (16:0). Rt 14,78: SQDG 32:3; MS- m/z 787,4581 [M-H] ; MS2- m/z 531,22 (16:3), 537,27 (16:0). Rt 13,77: SQDG 32:1; MS- m/z 791,4852 [M-H] ; MS2- m/z 537,27 (16:0), 535,25 (16:1). Rt 13,35: SQDG 32:0; MS- m/z 793,4968 [M-H] ; MS2- m/z 537,27 (16:0), 255,23 (16:0). Rt 12,63: SQDG 33:0; MS- m/z 807,5305 [M-H] ; MS2- m/z 551,28 (17:0), 537,27 (16:0). Rt 14,43 : SQDG 34:4; MS- m/z 813,4741 [M-H] ; MS2- m/z 557,24 (18:4), 537,27 (16:0). Rt 13,83: SQDG 34:3; MS- m/z 815,4898 [M-H] ; MS2- m/z 559,25 (18:3), 537,27 (16:0). Rt 13,59: SQDG 34:2; MS- m/z 817,5037 [M-H] ; MS2- m/z 561,26 (18:2), 537,27 (16:0). Rt 12,72: SQDG 34:1; MS- m/z 819,5215 [M-H] ; MS2- m/z 563,29 (18:1), 537,27 (16:0). Rt 12,27: SQDG 34:0; MS- m/z 821,5428 [M-H] ; MS2- m/z 565,3 (18:0), 537,27 (16:0). Rt 13,81: SQDG 36:5; MS- m/z 839,4929 [M-H] ; MS2- m/z 583,25 (20:5), 537,27 (16:0). Rt 13,38: SQDG 36:4; MS- m/z 841,5035 [M-H] ; MS2- m/z 585,26 (20:4), 537,27 (16:0). Rt 12,03: SQDG 36:1; MS- m/z 847,5579 [M-H] ; MS2- m/z 591,32