Đại hoàng đã được đánh giá in silico tác dụng kháng viêm trên hai đích 1ALU (IL-6) và 2AZ5 (TNF-). Kết quả tính toán cho thấy hợp chất emodin và rhapontigenin có khả năng tương tác tốt với 2 protein 1ALU (IL-6) và 2AZ5 (TNF-) tương ứng với khả năng ức chế sản sinh cytokin IL-6 và TNF-. Hợp chrysophanol có có khả năng ức chế cytokin IL-6.
Qua tìm hiểu các thử nghiệm in vitro, in vivo các nhà nghiên cứu đã chứng minh emodin ức chế đáng kể sự tăng các yếu tố viêm trong tế bào RAW 246.7 [15] và đóng vai trò như một chất giảm đau mạnh để điều trị và ngăn ngừa bệnh tiểu đường (DNP) thông qua việc làm giảm các yếu viêm như IL-6, TNF- IL- 1β [51]. Hợp chất rhapontigenin đã được Fan cùng cộng sự chứng minh có tác dụng bảo vệ tim mạch ức chế thông qua ức chế đáng kể sự tăng các yếu tố viêm (TNF-α, IL-6, MD, SOD, p38, and iNOs) [16]. Như vậy, việc đánh giá khả năng kháng viêm của hợp chất emodin và rhapontigenin bằng in silico là có phù hợp với các nghiên cứu trước đây.
3.3. HOẠT TÍNH ỨC CHẾ SỰ SẢN SINH NO CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐƯỢC PHÂN LẬP PHÂN LẬP
Ba hợp chất chrysophanol, emodin và rhapontigenin đem đánh giá tác dụng kháng viêm qua phép thử ức chế sản sinh NO in vitro. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 3.3 và bảng 3.7. Ở nồng độ thử nghiệm của ba hợp chất này số lượng tế bào còn sống trên 80%.
Hình 3.3: Đường chuẩn NaNO2
Bảng 3.7: Khả năng ức chế sản sinh NO của các chất phân lập được Nồng độ (µg/mL) MC565 Chrysophanol MC566 Emodin MC567 Rhapontigenin Chất đối chứng L-NMMA % ức chế NO % ức chế NO % ức chế NO % ức chế NO 100 32,06 97,98 91,26 96,83 20 27,35 34,75 87,22 70,76 4 13,90 28,03 50,26 34,64 0.8 -2,24 7,85 6,16 12,03 IC50 >100 32,26±1,05 5,65±0,43 7,78±0,33 Ở nồng độ 4 µg/mL các hợp chất MC565; MC566; MC567 thể hiện hoạt tính ức chế NO với giá trị lần lượt là 13;90; 28;03; 50;26% (Bảng 3.8). Với giá trị lớn hơn 50% là hợp chất đó có khả năng ức chế sản sinh NO. Điều này cho thấy; hợp chất MC567 có khả năng kháng viêm ngay ở nồng độ 4 µg/mL. Chứng tỏ; emodin có hoạt tính kháng viêm mạnh. y = 0.0091x + 0.046 R² = 0.9998 0 0.5 1 1.5 0 20 40 60 80 100 120 Đường chuẩn NO
Ở nồng độ 20 µg/mL các hợp chất MC565; MC566; MC567 thể hiện hoạt tính ức chế NO với giá trị lần lượt là 27;35; 34;75; 87;22%. Thấy rằng MC567 ức chế tốt sự sản sinh NO với giá trị 87;22%.
Ở nồng độ 100 µg/mL hợp chất MC565; MC566; MC567 thể hiện hoạt tính ức chế NO với giá trị lần lượt là 32;06; 97;98; 91;26%. Hợp chất MC567 thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt khi tăng nồng độ. Hợp chất MC566 có khả năng ức chế sản sinh NO khi được thử nghiệm với nồng độ cao.
Từ kết quả trên; cho thấy emodin (MC567) có khả năng ức chế sản sinh NO tốt nhất trên cả 3 nồng độ thử nghiệm với giá trị IC50 = 5.65±0.43 µg/mL. Rhapontigenin (MC566) có khả năng ức chế sản sinh NO ở nồng độ (100 µg/mL) với giá trị IC50 = 32;26±1;05 µg/mL.
Kết hợp giữa in silico và in vitro cho thấy hai hợp chất emodin và rhapontigenin đều có khả năng kháng viêm. Hai hợp chất emodin và chrysophanol đều cùng một khung anthraquinon nhưng hợp chất emodin lại có hoạt tính sinh học khác so với chrysophanol. Chứng tỏ rằng việc có thêm một nhóm OH ở vị trí C-3 của emodin chính là tác nhân gây ra sự khác biệt về hoạt tính sinh học của hai hợp chất.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Đề tài đã đạt được mục tiêu là phân lập một số hợp chất từ cây Đại hoàng (Rheum officinale Baill.) và xác định hoạt tính kháng viêm in silico và in vitro của các hợp chất. Cụ thể như sau:
Về thành phần hóa học:
Từ thân cây Đại hoàng đã phân lập được 3 chất sạch. Trong đó có 2 chất thuộc lớp anthraqunon là chrysophanol (MC565); emodin (MC567). Và 1 hợp chất stilben là rhapontigenin (MC566).
Vê docking phân tử (in silico):
Ba hợp chất thu được đã sử dụng mô hình docking phân tử để nghiên cứu về khả năng kháng viêm từ đó bước đầu đưa ra một số nhận xét lý thú về hoạt tính sinh học của hợp chất. Các thông số trong mô hình này có thể được tiếp tục tinh chỉnh để có thể có ứng dụng tốt hơn trong nghiên cứu phát triển các hoạt chất sinh học từ thiên nhiên.
Với đích cytokin IL-6 cả ba hợp chất chrysophanol; rhapontigenin và emodin đều có ái lực liên kết cao và thể hiện khả năng kháng viêm.
Với đích cytokin TNF- hai hợp chất rhapontigenin và emodin đều thể hiện khả năng tương tác tốt với protein 2AZ5 và thể hiện hoạt tính kháng viêm.
Về hoạt tính ức chế sản sinh NO:
Trong 3 hợp chất sạch phân lập được có: Hợp chất chrysophanol chưa thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu. Hai hợp chất còn lại là emodin và rhapontigenin đã thể hiện hoạt tính ức chế sinh NO với giá trị IC50 từ 5.65 – 32.26 µg/mL.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục phân lập và đánh giá tác dụng kháng viêm in vitro của các hợp chất từ cây Đại hoàng trên với các yếu tố tiền viêm khác như IL-6; TNF-; COX-2. - Tiếp tục tìm hiểu về vùng tương tác và các aminoaxit liên quan đến enzyme
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang Jun-shan, Xu Xu-dong (2013), “Review of Rhubarbs: Chemistry and Pharmacology”, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.
2. Misra, D. P., Agarwal, V., & Negi, V. S. 2016. Rheumatology in India: A Bird’s Eye View on Organization, Epidemiology, Training Programs and Publications. Journal of Korean Medical Science, 31(7), 1013–1019. https://doi.org/10.3346/jkms.2016.31.7.1013
3. Takitani, Shoji, et al, 1992, The pharmacopoeia of Japan XII, The Society of Japanese Pharmacopoeia, Tokyo.
4. Phạm Hoàng Hộ, 2000, Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản trẻ, tập I, 743.
5. Võ Văn Chi, 2012, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học, Tập I, 865- 866
6. Li Anjen, Bao Bojian, Alisa E. Grabovskaya-Borodina, Suk-pyo Hong, John McNeill, Sergei L. Mosyakin, Hideaki Ohba, Chong-wook Park, 2003, Polygonaceae, Flora of China 5, 277-350.
7. Bộ môn dược liệu 2004, Bài giảng dược liệu tập I, Nhà xuất bản Đại học dược Hà Nội.
8. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang Jun-shan, Xu Xu-dong, 2013, Review of Rhubarbs: Chemistry and Pharmacology, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.
9. Agarwal, Santosh K Singh, Sudhir S Lakshmi, Vijai Verma, Sushma Kumar, Sushil (2001 Jan), “Chemistry and Pharmacology of Rhubarb (Rheum species), Journal of Scientific & Industrial Research, 60 (1), 1-9.
10. Li F, Wang SC, Wang X, Ren QY, Wang W, Shang GW, Zhang L, Zhang SH, 2008, Novel exploration of cathartic pharmacology induced by rhubarb,
China J Chin Mater Med, 33(4): 481-484.
11. Rokaya, M.B., Münzbergová, Z., Timsina, B. & Bhattarai, K.R., 2012, Rheum australe D. Don: A review of its botany, ethnobotany, phytochemistry and pharmacology, Journal of Ethnopharmacology, 141(3), 761–774.
12. Xiao. B., Guo. J., Liu. D., Zhang. S., 2007, Aloe-emodin induces in vitro G2/M arrest and alkaline phosphatase activation in human oral cancer KB cells, Oral Oncology, 43(9), 905–910.
13. Eman A. Ibrahim, Doha H. Abou Baker, Farouk K. El-Baz1, 2016, Anti- Inflammatory and Antioxidant Activities of Rhubarb Roots Extract, Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., 39(2), 93-99.
14. Chu. X., Wei. M., Yang. X., Cao. Q., Xie. X., Guan. M., Wang. D. &., Deng. X., 2012, Effects of an anthraquinone derivative from Rheum officinale Baill, emodin, on airway responses in a murine model of asthma, Food and Chemical Toxicology, 50(7), 2368–2375.
15. Young-Jin Kim, Ji Young Lee, Hyun-Ju Kim, Do-Hoon Kim, Tae Hee Lee, Mi Suk Kang, You-Kyung Choi, Hye Lim Lee, Jaieun Kim, Hyo-Jin An, and Wansu Park, 2017, inhibitory effect of emodin on raw 264.7 activated with double stranded rna analogue poly i:c, Afr J Tradit Complement Altern Med., 14 (3), 157-166.
16. Fan, 2019, Cardioprotective Effect of Rhapontigenin in Isoproterenol- Induced Myocardial Infarction in a Rat Mode, Pharmacology, 103,291–302, DOI: 10.1159/000496800.
17. Akhtar MS, Amin M, Ahmad M, Alamgeer, 2009, Hepatoprotective Effect of Rheum emodi Roots Revandchini and Akseer-e-Jigar Against Par acetamol-induced Hepatotoxicity in Rats, Ethnobotanical Leaflets, 13, 310- 315.
18. Xing XY, Zhao YL, Kong WJ, Wang JB, Jia L, Zhang P, Yan D, Zhong YW, Li RS, Xiao XH, 2011, Investigation of the “dose-time- response” relationships of rhubarb on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats,
J Ethnopharmacol, 135(2), 575-581.
19. Zheng Qing-xia, Wu Hai-feng, Guo Jian, Nan Hai-jiang, Chen Shi-lin, Yang Jun-shan, Xu Xu-dong, 2013, Review of Rhubarbs: Chemistry and Pharmacology, Chinese Herbal Medicines, 5(1): 9-32.
20. Xing XY, Zhao YL, Kong WJ, Wang JB, Jia L, Zhang P, Yan D, Zhong YW, Li RS, Xiao XH, 2011, Investigation of the “dose-time- response”
relationships of rhubarb on carbon tetrachloride-induced liver injury in rats,
J Ethnopharmacol, 135(2), 575-581.
21. Hai-Rong Xiong, Jun Luo, Wei Hou, Hong Xiao, Zhan-Qiu Yang, 2011, The effect of emodin, an anthraquinone derivative extracted from the roots of Rheum tanguticum, against herpes simplex virus in vitro and in vivo, Journal of Ethnopharmacology, 133,718–723.
22. Min Chen, Tie-Gui Nan, Jie Xin, Li Cui, Bo Zhang, Xiao Wang, Bao-Min Wang, 2020, Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Method for the Detection of Rhein in Rheum officinale, International Journal of Analytical Chemistry, DOI:10.1155/2020/4294826.
23. Huang Q., Lu G., Shen H.M., Chung M.C.M., Ong C.N., 2007, Anti-cancer properties of anthraquinones from rhubarb, Medicinal Research Reviews, 27(5), 609–630.
24. Jia X., Iwanowycz S., Wang J., Saaoud F., Yu F., Wang Y., Hu J., Chatterjee S., Wang Q., Fan D., 2014, Emodin attenuates systemic and liver inflammation in hyperlipidemic mice administrated with lipopolysaccharides, Experimental Biology and Medicine, 239(8), 1025– 1035.
25. Yao W.Y., Zhou Y.F., Qian A.H., Zhang Y.P., Qiao M.M., Zhai Z.K., Yuan, Y.Z., Yang S.L., 2015, Emodin has a protective effect in cases of severe acute pancreatitis via inhibition of nuclear factor-κB activation resulting in antioxidation, Molecular Medicine Reports, 11(2), 1416–1420.
26. Ho T., Wu S., Chen J., Li C., Hsiang C., 2007, Emodin blocks the SARS coronavirus spike protein and angiotensin-converting enzyme 2 interaction,
Antiviral Research, 74(2), 92–101.
27. Dang S. S., Jia X. L., Song P., Cheng Y. A., Zhang X., Sun M. Z., Liu E. Q., 2009, Inhibitory effect of emodin and Astragalus polysaccharide on the replication of HBV, World journal of gastroenterology: WJG, 15(45), 5669. 28. Cao F., Peng W., Li X., Liu M., Li B., Qin R., Jiang W., Cen Y., Pan X., Yan
Z., Xiao K., Zhou H., 2015, Emodin is identified as the active component of ether extracts from Rhizoma Polygoni Cuspidati, for anti-MRSA activity,
29. Duan F., Xin, G., Niu, H. & Huang, W., 2017, Chlorinated emodin as a natural antibacterial agent against drug-resistant bacteria through dual influence on bacterial cell membranes and DNA, Scientific Reports, 7(1), 12721.
30. Wen, C., Zhang, J., Zhang, H., Dzah, C.S., Zandile, M., Duan, Y., Ma, H. & Luo, X., 2018, Advances in ultrasound assisted extraction of bioactive compounds from cash crops – A review, Ultrasonics Sonochemistry, 48, 538–549.
31. Cai Sun, M., Xing J., Corke H., 2004, Antioxidant Phenolic Constituents in Roots of Rheum officinale and Rubia cordifolia: Structure−Radical Scavenging Activity Relationships, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(26), 7884–7890.
32. Holtje H. D., Sippl W., Rognan D., Folkers G, 2003, Molecular Modeling: Basic Principles and Application, 3rd edition, Wiley-VCH, Verlag GmbH & Co. KGaA Weinheim.
33. Narsinghani, T., Sharma, M.C. & Bhargav, S., 2013, Synthesis, docking studies and antioxidant activity of some chalcone and aurone derivatives’,
Medicinal Chemistry Research, 22(9), 4059–4068.
34. Cherupally Dayakar, Buddana Sudheer Kumar, Galande Sneha, Gudem Sagarika, Koneru Meghana, Sistla Ramakrishna, Reddy Shetty Prakasham,, Bhimapaka China Raju a, 2017, Synthesis, pharmacological activities and molecular docking studies of pyrazolyltriazoles as anti-bacterial and anti- inflammatory agents, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 25, 5678- 5691. 35. Yu-Chuan Chang, Yi-An Tung, Ko-Han Lee, Ting-Fu Chen, Yu-Chun
Hsiao, HungChing Chang, Tsung-Ting Hsieh, Chan-Hung Su, Su-Shia Wang, Jheng-Ying Yu, Shangshung Shih, Yu-Hsiang Lin, Yin-Hung Lin, Yi-Chin Ethan Tu, Chun-Wei Tung, Chien-Yu Chen, 2020, Potential therapeutic agents for COVID-19 based on the analysis of protease and RNA polymerase docking, doi: 10.20944/preprints202002.0242.v1.
36. Nicolau L.A.D., Nolêto I.R.S.G., Medeiros J.V.R., 2020, Could a specific ACE2 activator drug improve the clinical outcome of SARS-CoV-2? A
potential pharmacological insight, Expert Review of Clinical Pharmacology, 13(8), 807–811.
37. Chang TN; Jeng SD; Yi CC; Lee CY; Liao JC; Lee MM; 2012; Ameliorative Effects of Scopoletin from Crossostephium chinensis against Inflammation Pain and Its Mechanisms in Mice. Evidence Based Complementary and Alternative Medicine; vol 2012; 1-10.
38. Cheenpracha S; Park EJ; Rostama B; Pezzuto JM; Chang LC (2010)
Inhibition of nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)- activated murine macrophage RAW 264.7 cells by the norsesterterpene peroxide, epimuqubilin A. Marine drugs; 8(3); 429-437.
39. Liao H; Banbury L; Liang H; Wang X; Lü X; Hu L; Wu J (2014) Effect of Honghua (Flos Carthami) on nitric oxide production in RAW 264.7 cells and α-glucosidase activity. Journal of Traditional Chinese Medicine 34(3): 362- 368.
40. Gaussian 09; Revision A.02; M. J. Frisch; G. W. Trucks; H. B. Schlegel; G. E. Scuseria; M. A. Robb; J. R. Cheeseman; G. Scalmani; V. Barone; G. A. Petersson; H. Nakatsuji; X. Li; M. Caricato; A. Marenich; J. Bloino; B. G. Janesko; R. Gomperts; B. Mennucci; H. P. Hratchian; J. V. Ortiz; A. F. Izmaylov; J. L. Sonnenberg; D. Williams-Young; F. Ding; F. Lipparini; F. Egidi; J. Goings; B. Peng; A. Petrone; T. Henderson; D. Ranasinghe; V. G. Zakrzewski; J. Gao; N. Rega; G. Zheng; W. Liang; M. Hada; M. Ehara; K. Toyota; R. Fukuda; J. Hasegawa; M. Ishida; T. Nakajima; Y. Honda; O. Kitao; H. Nakai; T. Vreven; K. Throssell; J. A. Montgomery; Jr.; J. E. Peralta; F. Ogliaro; M. Bearpark; J. J. Heyd; E. Brothers; K. N. Kudin; V. N. Staroverov; T. Keith; R. Kobayashi; J. Normand; K. Raghavachari; A. Rendell; J. C. Burant; S. S. Iyengar; J. Tomasi; M. Cossi; J. M. Millam; M. Klene; C. Adamo; R. Cammi; J. W. Ochterski; R. L. Martin; K. Morokuma; O. Farkas; J. B. Foresman; and D. J. Fox; Gaussian; Inc.; Wallingford CT; 2016.
41. Legiawati, L., Fadilah, F., Bramono, K. & Indriatmi, W., 2018, ‘In silico Study of Centella Asiatica Active Compounds as Anti-Inflammatory Agent
by Decreasing Il-1 And Il-6 Activity, Promoting Il-4 Activity’, J. Pharm. Sci., 10, 6.
42. Garrett M. Morris, David S. Goodsell, Robert S. Halliday, Ruth Huey, William E. Hart, Richard K. Belew, Arthur J. Olson, 1998, Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy Function, Journal of Computational Chemistry, Vol. 19, No. 14, 1639-1662.
43. 43. Pham D. Q., Ba D. T., Dao N. T., Choi G. J., Vu T. T., Kim J. C., Le Dang Q., 2017, Antimicrobial efficacy of extracts and constituents fractionated from Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. rhizomes against phytopathogenic fungi and bacteria. Industrial Crops and Products, 108, 442-450.
44. Duong Quang Pham, Antimicrobial efficacy of extracts and constituents fractionated from Rheum tanguticum Maxim. ex Balf. rhizomes against phytopathogenic fungi and bacteria, Industrial Crops & Products, 108 (2017) 442-480.
45. Danielsen, K., Aksnes, D. W., & Francis, G. W.,1992, NMR study of some anthraquinones from rhubarb. Magnetic Resonance in Chemistry, 30(4), 359-360.
46. Wells, J. M., Cole, R. J., & Kirksey, J. W., 1975, Emodin, a toxic metabolite of Aspergillus wentii isolated from weevil-damaged chestnuts. Applied Microbiology, 30(1), 26-28.
47. Zinaye, B. (2008). Phytochemical investigation on the root of Rumex abyssinicus (MAKMAKO) (Doctoral dissertation, Addis Ababa University). 48. Lutfiye Omur DEMIREZER, Nadire OZENVER, Mine UZU, Onur
YUKSELEN Zuhal GUVENALP, Osman Ugur SEZERMAN, 2016, Molecular Docking of Anthranoids on Some Targeted Human Proteins, FABAD J. Pharm. Sci., 41, 1-16.
49. Cherupally Dayakar, Buddana Sudheer Kumar, Galande Sneha, Gudem Sagarika, Koneru Meghana, Sistla Ramakrishna, Reddy Shetty Prakasham, Bhimapaka China Raju, 2017, Synthesis, pharmacological activities and
inflammatory agents, Bioorganic & Medicinal Chemistry, September.
http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2017.08.042
50. Ravi Jarapula, Kiran Gangarapu, Sarangapani Manda, and Sriram Rekulapally, 2018, Synthesis, In Vivo Anti-Inflammatory Activity, and Molecular Docking Studies of New Isatin Derivative, International Immunopharmacology 54 238–244, https://doi.org/10.1155/2016/2181027. 51. Ya-Fang Chen, Yin-Hui Huang, Mei-li Yang, Zhi-Qiang Lin, 2020, Emodin
ameliorates diabetic neuropathic pain through inhibiting up-regulation of TRPV1 and pro-inflammatory cytokines in dorsal root ganglions in rats, Neurology Asia, 25(3), p331-339.
PHỤ LỤC 1
Hình ảnh phổ 1H-NMR; 13C-NMR; DEPT của 3 hợp chất sạch thu được
Phổ 1H-NMR của hợp chất MC565