Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2. Phân tích trong phịng thí nghiệm
2.2.2.1. Xử lý mẫu và giám định tên loài rong Câu theo cách tiếp cận hình thái
Chuẩn bị mẫu vật: Các mẫu vật sau khi thu thập đƣợc rửa sạch loại bỏ bùn cát, sinh vật biểu sinh, tiến hành làm tiêu bản mẫu, chụp hình mẫu tƣơi và mẫu phân tích sinh học phân tử. Các mẫu rong đƣợc mã hóa và ép trên bìa cứng kích thƣớc A3 hoặc A4, trên bề mặt mẫu vật phủ một lớp vải chống dính và ép cố định lên tiêu bản giấy. Chụp hình tiêu bản mẫu với các đặc điểm liên quan đến hình thái gồm: Kích thƣớc tản, cách phân nhánh, đế bám, cơ quan sinh sản. Tiến hành sấy tập tiêu bản mẫu trong tủ sấy Memmert ở nhiệt độ 600C trong 48 giờ.
Trên cơ sở các mẫu rong câu thu thập, tiến hành lựa chọn các mẫu điển hình có đầy đủ các đặc điểm để định loại theo phƣơng pháp so sánh hình thái và giải phẫu.
Phân loại hình thái để xác định lồi, rong khơ hay tƣơi đƣợc ngâm nƣớc muối trƣớc khi tiến hành cắt. Lựa chọn phần gốc, ngọn, thân và tảo quả (nếu có) cắt để quan sát. Trong q trình cắt, rong đƣợc kiềm bằng nhíp ở tay trái, tay phải giữ dao lam cắt rong theo chiều ngang theo những lát mỏng. Chụp hình các mặt cắt ngang của gốc, thân, ngọn và cơ quan sinh sản của rong câu bằng kính hiển vi Olympus BX41 và kính hiển vi Olympus SZ51 làm cơ sở dữ liệu cho phân loại hình thái.
Hình 2. 4. Mẫu rong câu thu tại điểm khảo sát
Mẫu đƣợc làm tiêu bản, phân tích định loại và lƣu giữ tại Phịng Thí nghiệm Sinh thái, Viện Sinh học Nhiệt đới. Mẫu vật thu thập đƣợc định loại dựa trên tài liệu Nguyễn Hữu Dinh (1993), Lê Nhƣ Hậu và Nguyễn Hữu Đại (2010), Lê Nhƣ Hậu (2012).
2.2.2.2. Xử lý mẫu, phân tích di truyền rong Câu bằng chỉ thị phân tử
Chuẩn bị mẫu vật: trên cơ sở mẫu vật đã thu thập, xử lý. Lựa chọn các nhánh rong gần đỉnh sinh trƣởng, tiến hành rửa và lau sạch các vật chất bám và sinh vật biểu sinh. Sử dụng giấy pubpil lau sạch bề mặt của rong và lau khô mẫu vật. Cho mẫu vật vào túi nilon có chứa silicagel hút ẩm hoặc ống eppendorf có chứa hút ẩm. Định kì thay silicagel khi hạt chuyển sang màu hồng cho tới lúc mẫu vật khơ hồn tồn.
* Lựa chọn marker phù hợp để định danh loài
Trong 3 loại chỉ thị phân tử tiềm năng để phân loại rong câu là COI, COI-5P, rbcLS. Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ly trích DNA.
Mẫu đƣợc bảo quản trong silicagel đƣợc miêu tả ở nội dung trên đƣợc lấy ra để tách chiết DNA. Mẫu đƣợc cho vào nitơ lỏng, đƣợc nghiền nát trong tube ly tâm. Quy trình ly trích DNA đƣợc thực hiện theo bộ kit TopPURE®
PLANT DNA EXTRACTION KIT nhƣ sau:
Cho 30-100mg mẫu vào tube 1,5mL. nghiền nát mẫu bằng chày nghiền mẫu. Để đạt hiệu suất thu DNA cao nhất nên nghiền mẫu trong nitơ lỏng.
Thêm 400µL PLS1 bufer vào tube 1,5mL chứa mẫu ở trên. Cho tiếp 10µL dung dịch Rnase A vào, vortex đều và ủ ở 65°C trong 30 phút. Vortex thƣờng xuyên trong khi ủ.
Cho 130µL PLS2 buffer vào, trộn đều và ủ 5 phút trong tủ mát.
Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 5 phút. Hút 300 µL dịch nổi chuyển sang tube 1,5 mL mới. Thêm vào 450 µL PBB buffer (tƣơng đƣơng 1,5 lần thể tích nổi), vortex đều.
Chuyển hỗn hợp sang cột Sillica đặt sẵn trong tube 2 mL (tối đa 600 µL). Ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dƣới. Lặp lại với phần hỗn hợp còn lại.
Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Thêm 500 µL PWB buffer và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút. Giữ lại cột và loại bỏ phần chất lỏng bên dƣới. Lặp lại bƣớc này 1 lần nữa.
Đặt lại cột vào tube 2 mL cũ. Làm khô cột bằng cách ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút.
Chuyển cột sang tube 1,5 mL. Thêm 100µL EB bufer và ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút, thu phần dịch chứa DNA bên dƣới.
DNA đƣợc sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -20°C.
Đoạn marker COI, COI-5P, rbcLS đƣợc khuếch đại bằng 3 cặp mồi tƣơng ứng đƣợc thể hiện ở Bảng 2.1. Quy trình PCR đƣợc thực hiện trong tube PCR 0,2ml với hai bộ hóa chất khác nhau lần lƣợt đƣợc thể hiện ở bảng 2.2 và bảng 2.3. Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR của từng cặp primer đƣợc cụ thể ở bảng 2.4.
Bảng 2. 5. Trình tự và vùng khuếch đại ba cặp mồi của ba marker COI, COI-5P, rbcLS
a W= A or T, R= A or G, Y= C or T, N= A, T, C or G.
Bảng 2. 6. Nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng bộ hóa chất BIO- 21105
Hóa chất Nồng độ cuối Thể tích sử dụng (µL)
5x MyTaq Reaction Buffer - 10
Template - 4
Primer R 20µM 4
Primer F 20µM 4
MyTaq HS DNA Polymerase - 1
Nƣớc cất - 27
Tổng thể tích 50
Bảng 2. 7. Nồng độ các thành phần trong phản ứng PCR sử dụng bộ hóa chất BIO- 25041 Hóa chất Nồng độ cuối Thể tích sử dụng (µL) MyTaq Mix, 2x - 25 Template - 4 Primer R 20µM 1 Primer F 20µM 1 Nƣớc cất - 19 Tổng thể tích 50
Marker Cặp mồi Trình tự cặp mồi 5’-3’ Kích thƣớc Tham khảo COI COXI43F TCAACAAATCATAAAGATATTGGAACT ⁓1500 bp Geraldino và ctv, 2006 COXI1549R AGGCATTTCTTCAAAGGTATGATA
COI-5P GazF2 CCAACCAYAAAGATATAGGTAC
a ⁓700 bp Lane và ctv, 2007 GazR2 GGATGACCAAARAACCAAAA a rbcLS rbcLS3F CATCGTGCTGGTAACTCTAC ? bp Mattio và ctv, 2008 rbcLSS97R CATCTGTCCATTCWACACTAAC a
Bảng 2. 8. Chu trình nhiệt khuếch đại chung của 3 chỉ thị phân tử
Giai đoạn Nhiệt độ (°C) Thời gian Chu kỳ
Biến tính ban đầu 94 4 phút
Biến tính 94 1 phút
Bắt cặp 1 phút
Kéo dài chuỗi 72 2 phút
Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút
Kết thúc phản ứng 4 ∞
Khi hoàn tất, sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng để tiếp tục qua bƣớc điện di hoặc bảo quản trong tủ lạnh để sử dụng cho thời gian lâu dài. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 1X. Sử dụng 5µL sản phẩm PCR trộn đều với 1 µL GelRed 6X và bơm
vào từng giếng. Điện di ở hiệu thế 86V trong vòng 40 phút. Cuối cùng, gel
đƣợc hiển thị dƣới ánh đèn UV và lƣu hình ảnh bằng điện thoại. Dựa vào hình ảnh gel, so sánh kết quả giữa các marker và đƣa ra kết luận marker nào hiển thị band đẹp và rõ nhất.
* Xây dựng cây phát sinh chủng loài
Sản phẩm PCR cho kết quả điện di tốt đƣợc đem đi giải trình tự ở cơng ty 1st BASE ở Malaysia bằng phƣơng pháp Sanger với nguyên tắc sử dụng deoxyribonucleotide triphosphate (ddNTPs) có đánh dấu huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh chóng và hiệu quả hơn và làm các điểm dừng để tổng hợp DNA ở các vị trí ngẫu nhiên. Các chuỗi trình tự thơ sau khi trả về, đƣợc BLAST trên NCBI GenBank (www. blast.ncbi.nlm.nih.gov) để xác định lồi và tìm trình tự tham chiếu với Max Score Total Score Total, Query Coverage gần bằng 100%, E-value khoảng 0, and Identity khoảng 100%.
Trình tự đoạn gen COI-5P đƣợc trình bày dƣới dạng sắc ký đồ và đƣợc chỉnh sửa nucleotide nhiễu trong phần mềm Bioedit. Phần đầu và phần cuối của chuỗi DNA đã đƣợc cắt (khoảng 40 bp) và các nucleotide nào khơng chính xác hoặc khơng rõ ràng đã đƣợc sửa chữa hoặc cắt bỏ để có kết quả chính xác nhất. Tiếp theo đó, các chuỗi trình tự đƣợc sắp xếp và lập cây phát
sinh loài trong phần mềm MEGA X. Cây di truyền đƣợc tạo ra để xác định vị trí, mối quan hệ của mẫu thí nghiệm với các lồi khác trên GeneBank.