6. Bố cục của khóa luận
2.4.1. Phương pháp chiết
Phương pháp chiết là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi nguyên liệu dựa vào đặc tính của chất cần chiết và dung môi, là sự phân bố giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và một pha rắn tạo cân bằng lỏng- rắn. Dung môi phân cực sẽ tách được chất phân cực còn dung môi không phân cực sẽ tách chất không phân cực.
Khi nguyên liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung môi thấm vào nguyên liệu, sau đó hòa tan những chất tan có trong tế bào nguyên liệu rồi được khuếch tán ra ngoài tế bào. Trong chiết xuất sẽ xảy ra một số quá trình như khuếch
tán, thẩm thấu, thẩm tích, hòa tan, ... và chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỉ lệ rắn-lỏng, độ mịn của nguyên liệu, ...
Có nhiều phương pháp chiết xuất nguyên liệu, có thể kể đến là phương pháp ngâm dầm, phương pháp ngấm kiệt, phương pháp đun hoàn lưu, phương pháp chiết soxhlet, ... Trong đó phương pháp chiết soxhlet là tối ưu hơn cả khi dùng ở điều kiện phòng thí nghiệm vì chiết kiệt được hoạt chất, tiết kiệm dung môi do chiết nóng hồi lưu.
Phương pháp chiết soxhlet: là một quá trình chiết liên tục, được lặp đi lặp lại nhiều lần một cách tự động nhằm chiết kiệt được hoạt chất. Bộ dụng cụ soxhlet bao gồm một bình cầu, một thiết bị chiết và một ống sinh hàn hồi lưu. Dung môi ở trong bình cầu được làm bốc hơi từng phần, rồi ngưng tụ nhỏ vào nguyên liệu chiết đựng trong một cái túi bằng giấy lọc và sau đó chảy lại vào bình cầu. Trong quá trình đó, cấu tử cần tách được làm giàu thêm trong dung môi. Đặc biệt, dụng cụ chiết soxhlet có một ống xi-phông đặt ở bên cạnh, chỉ để dung dịch chiết chảy vào bình khi nào mức chất lỏng trong ống chiết đạt được khuỷu trên của ống xi-phông. (Hình 2.4)
Hình 2.4. Bộ dụng cụ Soxhlet 2.4.2. Khảo sát các điều kiện chiết tối ưu
Để khảo sát các điều kiện chiết tối ưu ta dùng phương pháp hấp thụ phân tử UV-VIS.
Phổ hấp thụ phân tử UV-VIS là phổ sinh ra do các điện tử hóa trị trong phân tử hay nhóm phân tử sẽ hấp thu năng lượng của chùm sáng kích thích (chùm bức xạ trong vùng UV-VIS) và chuyển lên trạng thái kích thích có mức năng lượng cao hơn (ζ
ζ*, π
π*, n
ζ*, n
π*). Phổ này chủ yếu nằm trong vùng sóng từ 190 – 900nm.
Khi chiếu một chùm sáng vào dung dịch màu thì một phần ánh sáng bị hấp thụ bởi dung dịch, một phần bị phản xạ lại, phần còn lại ló ra cho ta màu của dung dịch.
Bảng 2.1. Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu
Như vậy nguyên tắc chung của phương pháp đo quang là để xác định một chất X nào đó, ta chuyển nó thành dung dịch màu có khả năng hấp thụ ánh sáng rồi đo sự hấp thụ ánh sáng của nó, từ đó suy ra hàm lượng chất cần xác định theo định luật Lambert – Beer: D =A= ε. l. C. Mật độ quang đo được ngoài tính chất tuyến tính với nồng độ dung dịch còn có đặc tính quan trọng là tính cộng tính, tức là giá trị đó chính là tổng giá trị các mật độ quang của các chất có trong dung dịch.
* Ứng dụng:
Dịch chiết hạt tiêu đen có màu lục hơi vàng nên sẽ hấp thụ chùm tia bức xạ nằm trong khoảng 400-450nm. Tiến hành quét bước sóng trong khoảng đó tìm giá trị λmax để tại đó giá trị mật độ quang là lớn nhất, tạo điều kiện chính xác cho phép đo.
Mật độ quang thu được là tổng giá trị các mật độ quang của các chất có trong dịch chiết hạt tiêu đen. Giá trị mật độ quang càng lớn thì hàm lượng các chất càng
cao, quá trình chiết càng triệt để. Dựa vào đó xác định các điều kiện tối ưu của dịch chiết.
*Cách tiến hành: Trong đề tài này tiến hành khảo sát 2 điều kiện chiết là thời gian chiết và tỉ lệ rắn – lỏng.
- Thời gian chiết: Tiến hành chiết soxhlet 20g bột hạt tiêu đen với cùng thể
tích etanol 960 ở nhiệt độ 800C trong các khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS để xác định thời gian tối ưu. (Hình 2.5)
- Tỷ lệ R/L: Tiến hành chiết soxhlet 20g bột hạt tiêu đen ở nhiệt độ 800C trong cùng một thời gian với thể tích etanol 960 lần lượt là 160ml, 180ml, 200ml, 220ml, 240ml. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS để xác định tỉ lệ R/L tối ưu. (Hình 2.6)
Hình 2.5. Khảo sát tỉ lệ R/L Hình 2.6. Khảo sát thời gian
2.5. Định tính alkaloid trong dịch chiết [1], [2], [3]
Alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi chung là thuốc thử alkaloid và chia làm 2 loại: phản ứng gây tủa và phản ứng màu đặc hiệu. Do điều kiện thí nghiệm nên đề tài này chỉ sử dụng 2 thuốc thử tạo tủa là Mayer và Bouchardat.
Chuẩn bị 3 ống nghiệm đựng dịch chiết hạt tiêu đen. Một ống làm ống chuẩn, 2 ống còn lại lần lượt cho thuốc thử Mayer và Bouchardat vào mỗi ống. Để yên, quan sát hiện tượng và nhận xét.
2.6. Xác định thành phần hóa học của hạt tiêu đen bằng ph ng pháp GC-MS [6], [8], [9]
Cân 20g bột tiêu đen cho vào bộ chiết soxhlet, chiết với 200ml etanol 960 ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ. Dịch chiết thu được đem cô đuổi dung môi thu được cắn. Cắn được phân tích trên máy sắc kí ghép khối phổ để định danh một số thành phần hóa học có trong hạt tiêu đen.
Sắc ký khí ghép khối phổ là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hệ thống được ghép nối giữa một thiết bị sắc ký và một thiết bị phổ khối lượng, điều khiển tự động bằng máy tính.
Sắc ký khí được dùng để chia tách hỗn hợp các chất ra các phần riêng lẻ. Pha động là một khí trơ (giống như helium) sẽ mang hỗn hợp mẫu đi qua pha tĩnh. Mỗi chất trong hỗn hợp pha động tương tác khác nhau với pha tĩnh, hợp chất tương tác nhanh ra khỏi cột trước, hợp chất tương tác chậm ra khỏi cột sau. Mỗi chất chia tách, rửa giải đi ra khỏi cột và đi vào đầu dò sẽ tạo thành một peak trong sắc đồ với thời gian lưu đặc trưng cho từng chất trong cùng điều kiện sắc kí.
Khối phổ được dùng để xác định các chất hóa học dựa trên cấu trúc của nó. Khi giải hấp các hợp chất riêng lẻ từ cột sắc ký, chúng đi vào đầu dò có dòng điện ion hóa và bị bắn phá thành các mảnh ion có khối lượng và điện tích. Các mảnh ion này sẽ được tách biệt khỏi nhau trong một từ trường theo tương quan giữa m và e. Phổ khối đồ thu được với trục hoành là giá trị m/e (số khối z) và trục tung là cường độ tín hiệu tương đối. Cấu trúc này được so sánh với một thư viện cấu trúc các chất đã biết trong thư viện phổ để định danh các hợp chất trong mẫu.
Sắc ký khí ghép khối phổ dùng để phân tích các hỗn hợp hóa chất phức tạp như xác định thành phần các chất hóa học, độc chất, kháng sinh, đánh giá độ tồn lưu của hóa chất diệt côn trùng khác nhau trong các vật liệu hoặc hợp chất khác nhau.
2.7. Thử hoạt tính sinh học [3], [16], [18]
2.7.1. Hoạt tính kháng sinh
Thử hoạt tính vi sinh vật được kiểm định theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, hoặc phương pháp đo độ đục trong môi trường lỏng tại phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học.
Các chủng vi sinh vật thử gồm:
- Vi khuẩn Gram (+): Staphylococccus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum.
- Vi khuẩn Gram (-): Salmonella enterica, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
- Nấm: Candida albican.
2.7.2. Hoạt tính độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào là một phép thử nhằm phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở điều kiện invitro. Trong phạm vi khóa luận này, cặn chiết hạt tiêu đen được thử khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô KB theo phương pháp Scudiero và cộng sự tại phòng Thử hoạt tính sinh học – Viện Hóa học.
Phương pháp thử: tế bào ung thư được duy trì liên tục ở các điều kiện chuẩn và tiến hành thử nghiệm với cặn chiết hạt tiêu đen được pha ở 5 thang nồng độ khác nhau (128, 32, 8, 2 và 0.5 μg/ml) trên 96 đĩa giếng. Các đĩa thử nghiệm này được ủ trong tủ ấm CO2 ở 370C để tế bào tiếp tục phát triển. Sau 3 – 5 ngày, các tế bào này được xử lý và xác định giá trị ức chế sinh trưởng từ đó tính được giá trị IC50.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả xác định một s chỉ tiêu hóa lý của hạt tiêu đen
3.1.1. Độ ẩm
Tiến hành xác định độ ẩm với số lượng mẫu được lấy là 5 mẫu. Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 5 mẫu. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độ ẩm trong hạt tiêu đen
STT m1 (g) 1 2 3 4 5
Từ bảng 3.1 cho thấy độ ẩm trung bình trong hạt tiêu đen tương đối cao: 14.702%. Với độ ẩm này cần phải cẩn trọng trong việc bảo quản nguyên liệu trong suốt quá trình nghiên cứu, tránh bị nấm mốc.
3.1.2. Hàm lượng tro
Lấy 5 mẫu hạt tiêu đen đã xác định độ ẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ 6000C. Hàm lượng tro được lấy trung bình từ 5 mẫu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng tro trong hạt tiêu đen
STT
1 2 3
5
Vậy hàm lượng tro trung bình trong hạt tiêu đen là: 4.184%. Tro này có thể là một số muối kim loại và các chất vô cơ.
3.1.3. Hàm lượng kim loại nặng
Mẫu hạt tiêu đen sau khi tro hoá hoàn toàn (như mục 2.3.2.), được hoà tan trong dung dịch axit HNO3 loãng và định mức bằng nước cất trong bình định mức 50ml. Sau đó xác định hàm lượng các kim loại nặng bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS tại Đài Khí tượng Thủy văn khu vực Trung Trung Bộ, 660 - Trưng Nữ Vương - Đà Nẵng. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hàm lượng kim loại nặng trong hạt tiêu đen
Kết quả khảo sát trên cho thấy hàm lượng một số các kim loại nặng (Cu, Pb) trong hạt tiêu đen nằm dưới mức giới hạn tối đa cho phép của QCVN 8-2:2011/BYT về giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong gia vị. Vì thế, việc sử dụng hạt tiêu đen trong các lĩnh vực liên quan như dược phẩm, thực phẩm, … sẽ không gây hại cho sức khỏe con người.
3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện chiết
3.2.1. Thời gian chiết
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào bộ soxhlet, chiết với 250 ml etanol 960. Tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 800C trong các khoảng thời gian khác nhau: 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 10 giờ, 12 giờ. Dịch chiết thu được đem đo UV- VIS tại bước sóng 417nm (hình 3.1). Giá trị mật độ quang của các mẫu được thể hiện ở bảng 3.4.
Kết quả khảo sát thời gian chiết được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo thời gian
Mẫu 1 2 3 4 5 Và được biểu diễn qua đồ thị như trong hình 3.2.
D 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 4
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào thời gian
Qua kết quả thu được ở bảng 3.4 và hình 3.2 ta thấy thời gian chiết tăng, làm tăng số lần chiết, tăng diện tích tiếp xúc và độ khuếch tán của dung môi vào nguyên liệu, nên có thể chiết được nhiều hoạt chất dẫn đến mật độ quang tăng. Giá trị mật độ quang lớn nhất tại thời gian 8 giờ. Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết, giá trị D giảm, do chiết nóng trong thời gian dài sẽ làm caryophyllene (một thành phần của tinh dầu) bay hơi. Hơn nữa nguyên liệu ngâm trong dung môi thời gian dài sẽ trương nở làm bít lổ thông của màng tế bào, cản trở khả năng thấm của dung môi, giảm hiệu suất chiết.
Như vậy thời gian chiết tối ưu là 8 giờ.
3.2.2. Tỷ lệ rắn lỏng
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào giấy lọc, gói lại thật kỹ, cuộn lại bằng chỉ, rồi cho vào bộ chiết soxhlet. Tiến hành chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ với thể tích dung môi etanol 960 lần lượt là: 160ml, 180ml, 200ml, 220ml, 240ml. Dịch chiết thu được có màu vàng lục, đem đo UV- VIS tại bước sóng 417nm (hình 3.3). Giá trị mật độ quang của các mẫu được thể hiện ở bảng 3.5.
Hình 3.3. Dịch chiết với các tỉ lệ R/L khác nhau
Kết quả khỏa sát tỷ lệ rắn lỏng được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả mật độ quang của các dịch chiết theo tỉ lệ rắn-lỏng
Mẫu 1 2 3 4 5
Và được biểu diễn qua đồ thị như trong hình 3.4 D
2.5 2.4
Hình 3.4. Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào tỉ lệ R/L
Qua kết quả và đồ thị ở bảng 3.5 và hình 3.4 ta nhận thấy cùng khối lượng nguyên liệu nhưng khi tăng thể tích dung môi thì giá trị mật độ quang ngày càng tăng. Nguyên nhân là do khi thể tích nhỏ, dung môi nhanh bão hòa; còn khi thể tích lớn sẽ làm tăng độ thẩm thấu, độ hòa tan của dung môi, tăng khả năng tiếp xúc với nguyên liệu dẫn đến tăng hiệu suất chiết. Đến một thể tích nhất định, lượng hoạt chất được tách ra gần như hoàn toàn và không thể chiết thêm được nữa khi tăng thể tích dung môi. Giá trị mật độ quang cực đại đạt được ở mẫu 3. Sau điểm cực đại, mật độ quang giảm không đáng kể và ổn định. Chứng tỏ tại điều kiện này, dịch chiết của hạt tiêu đen chứa lượng chất chiết là lớn nhất.
Như vậy tỷ lệ R/L tối ưu là 1/10.
3.3. Kết quả định tính alkaloid trong dịch chiết hạt têu đen
Dịch chiết hạt tiêu đen với etanol 960 đem thử định tính alkaloid với các thuốc thử Mayer và Bouchardat, ta có kết quả thử định tính alkaloid như sau:
* Thuốc thử Mayer:
Ống 1: Ống chuẩn chứa dịch chiết.
Ống 2: Ống thử chứa dịch chiết rồi nhỏ từ từ thuốc thử Mayer vào, nhận thấy kết tủa màu vàng trắng, không tan trong dung dịch axit H2SO4 loãng. (Hình 3.5)
* Thuốc thử Bouchardat:
Ống 3: Ống chuẩn chứa dịch chiết.
Ống 4: Ống thử chứa dịch chiết rồi nhỏ từ từ thuốc thử Bouchardat vào, nhận thấy có kết tủa màu nâu đậm. (Hình 3.6)
2 1 3 4
Hình 3.5. Dịch chiết với Hình 3.6. Dịch chiết với thuốc
thuốc thử Mayer thử Bouchardat
=> Kết luận: Dịch chiết hạt tiêu đen có chứa alkaloid.
3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học của dịch chiết hạt tiêu đen bằngph ng pháp GC-MS ph ng pháp GC-MS
Cân 20g bột hạt tiêu đen cho vào giấy lọc, gói lại thật kỹ, cuộn lại bằng chỉ, rồi cho vào bộ chiết soxhlet. Tiến hành chiết ở nhiệt độ 800C trong thời gian 8 giờ với 200 ml dung môi etanol 960. Dịch chiết thu được có màu vàng lục. Cô đuổi dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cắn. Gửi cắn đi phân tích trên máy sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) tại Trung tâm Kỹ Thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2, số 2 Ngô Quyền –Sơn Trà –Đà Nẵng.
Kết quả định danh các cấu tử trong cắn hạt tiêu đen bằng GC-MS được thể hiện ở sắc kí đồ hình 3.7 và phổ khối hình 3.8, 3.9:
Hình 3.8. Phổ khối của piperine.
Hình 3.9. Phổ khối của Caryophyllene
Từ sắc kí đồ - khối phổ thu được cho thấy thành phần chính của cắn chiết từ