2.2.6. T ng quan v các nghiên c u trên th gi i và trong n c v phân tích trans fat trong th c ph m trong th c ph m
• Nh ng nghiên c u ngồi n c
- N m 2006, Zhiliang Huang và các c ng s đã đ a ra ph ng pháp phân tích TFA b ng cách s d ng GC-MS và c t AT-Silar-90, [44]. Nghiên c u c a Zhiliang Huang và các c ng s nh m đánh giá m t ph ng pháp s c ký khí đ n gi n d a trên ph ng pháp AOAC 996.06 v phân tích hàm l ng các trans fat cĩ trong các m u th c ph m. Ph ng pháp đã tách đ c hồn tồn 10 lo i TFA v i các chu n đ ng phân d ng cis và thành ph n hĩa h c c a các peak đ c xác đnh b ng vi c s d ng kh i ph . K t qu này ch ng minh r ng quá trình methyl hĩa và chi t b ng hexan s d ng trong ph ng pháp này là hi u qu và phù h p trong phân tích TFA.
- N m 2009, trong H i ngh Báo cáo đ tài Th c s t i khoa Cơng ngh Th c ph m tr ng i h c Silpakorn Thái Lan, Anchalee Arunrat đã gi i thi u m t nghiên c u, [8] : nh tính và đnh l ng các TFA cĩ trong th c ph m b ng vi c s d ng Quang ph h ng ngo i fourier (FTIR). Theo nghiên c u này, các c u hình d ng trans h p th b c
sĩng h ng ngo i vùng 1000-950 cm-1, trong khi đĩ c u hình d ng cis h p th vùng b c sĩng là 780-680 cm-1.
-N m 2009, Tsuzuki W và Ushida K, [40], đã s d ng s c ký l ng pha đ o hi u n ng cao (RP-HPLC) đ phân tích các đ ng phân d ng cis và trans c a các axit béo đã metyl este hĩa (FAMEs) cĩ trong các lo i d u n. Các đ ng phân d ng trans c a các FAMEs C16:1, C18:1, C18:2, C18:3, C20:1 và C22:1 đ c tách ra nhanh chĩng kh i các đ ng ph n d ng cis nh c t C18 Cholester COSMOSIL (4.6 mmI.D* 250 mm, Nacalai Tesque) ho c c t TSKgel ODS-100Z (4.6 mmI.D* 250 mm, TOSOH), pha đ ng là ACN. Ph ng pháp này đã đ c ng d ng đ xác đnh các đ ng phân d ng cis và trans c a C18:1 trong d u h t c i đã hydro hĩa m t ph n. Hi u su t thu h i đ ng phân cis và trans c a ph ng pháp RP-HPLC là 98%, t t h n so v i ph ng pháp GC. Nh ng k t qu thu nh n đ c trong nghiên c u này cho th y vi c s d ng ph ng pháp RP-HPLC là m t cơng c m nh đ phân tích các TFA trong d u n và các s n ph m th c ph m nh là m t thay th cho ph ng pháp s c ký ion-b c.
• Nh ng nghiên c u trong n c
PGS.TS. Phan Th S u, Giám đ c Trung tâm k thu t An tồn v sinh th c ph m, thu c h i Khoa h c K thu t An tồn th c ph m Vi t Nam cho bi t: Thành ph n c a mì n li n ch a nhi u ch t béo bão hịa, ch t b t và ít ch t x . áng chú ý, mì n li n cĩ thành ph n ch t béo (Shotrerning) t 15-20%, ch y u là d ng axit béo no (axit béo bão hịa) là lo i ch t béo khĩ tiêu hĩa. Ngồi ra, mì n li n cịn cĩ ch t béo d ng trans. Theo k t qu phân tích c a Trung tâm D ch v Phân tích Thí nghi m thu c S Khoa h c & Cơng ngh TP.HCM thì cĩ t i 38% s m u mì gĩi đang l u thơng trên th tr ng đ c phát hi n cĩ ch a trans fat.
Nh ng c nh báo v nguy c khơng t t cho s c kh e, đ c bi t là ch t béo d ng trans cĩ trong mì n li n khơng ph i đ n nay m i đ c đ c p đ n. Theo GS. TS Hồng c Nh , Phĩ Ch t ch h i Dinh d ng TP.HCM thì t n m 2007 đã cĩ nh ng c nh báo v v n đ này. Tuy nhiên, c quan qu n lý Nhà n c quá ch m, đ n nay v n ch a đ a ra đ c gi i h n v trans fat trong th c ph m, ch a cĩ tiêu chu n v ph ng pháp phân tích.
Ta th y trên th gi i và c Vi t Nam, ch a cĩ cơng trình nghiên c u nào s d ng GC-MS (đ u dị b y ion, Iontrap) v i vi c s d ng c t HP-88 đ phân tích các transfat trong s n ph m margarine. Tây Ban Nha và Pakistan c ng đã phân tích các TFA trong s n ph m margarine b ng GC-MS nh ng v i các đi u ki n khác nhau, Tây Ban Nha s d ng c t SP-2560, đ u dị MS 7070 EQ (Variant), [17], hay s d ng GC k t h p v i Ag-TLC, cịn Pakistan s d ng c t HP-5MS và detector là MS-5975(Agilent), [6].
2.3. CÁC PH NG PHÁP XÁC NH TRANS FAT
2.3.1. S d ng Quang ph H ng ngo i FTIR, [7, 9, 10, 32]
S d ng quang ph h ng ngo i và s c ký khí đ xác đnh hàm l ng trans trong các lo i d u m đã đ c nghiên c u và tiêu chu n hĩa b i AOCS, AOAC và IUPAC (2, 39). AOCS cĩ đ chính xác t ng t v i ph ng pháp AOAC và đ c s d ng đ phân tích đ ng th i c triglycerit, metyl este hay các axit béo ch a t o thành metyl este.
Nguyên t c c a quang ph h ng ngo i IR trong phân tích trans fat là:
- M t liên k t đơi d ng trans h p th vùng h ng ngo i b c sĩng 967 cm-1. - Khi m t liên k t đơi d ng trans liên h p v i m t liên k t đơi d ng cis ho c 2 liên
k t đơi d ng trans thì b c sĩng b di d i t i vùng cao h n là 983 cm-1. - N u cĩ 3 liên k t đơi d ng trans thì b c sĩng h p th vùng 994 cm-1.
Ph ng pháp này c ng cĩ th áp d ng đ xác đnh các liên k t đơi trans trong ch t béo khi đã đ c t o d n xu t metyl este hĩa và vùng IR h p th b c sĩng t 900 t i 1050 cm-1. Khi đĩ di n tích peak trans đ c so sánh v i đ ng chu n d ng b i dung d ch chu n methyl elaidate. Tuy nhiên hàm l ng trans fat th p thì vi c xác đnh các đ ng phân liên h p khơng cịn chính xác n a.
M t k thu t m i là quang ph h ng ngo i bi n đ i Fourier cĩ kh n ng xác đnh các liên k t đơi d ng trans phân l p trong các m u d u m th ng m i v i đ chính xác cao h n r t nhi u và các b c chu n b m u c ng đ n gi n h n do nĩ khơng c n ph i t o d n xu t hay hịa trong dung mơi tr c khi phân tích; nĩ c ng cĩ kh n ng t đ ng hĩa khâu x lý m u và thu th p s li u thơng qua máy tính. Gi i h n phát hi n trong ph ng
pháp này là hàm l ng monoene trans d i 2%. chính xác c a ph ng pháp đ i v i nh ng m u nh margarine v n cịn gi i h n do cĩ nhi u axit béo khơng bão hịa d ng trans, nh ng hàm l ng nh và nh h n các sai s c a ph ng pháp r t nhi u.
u đi m c a ph ng pháp FTIR: th i gian phân tích nhanh( kho ng 5 phút cho m t l n phân tích), thao tác chu n b m u đ n gi n cĩ th đnh l ng trans fat mà khơng c n ph i metyl este hĩa m u.
Nh c đi m c a FTIR là đ nh y và đ chính xác kém h n so v i ph ng pháp GC. Ngồi ra ph ng pháp FTIR c ng khơng cho thơng tin v thành ph n c ng nh v trí c a các liên k t đơi c a các axit béo. Vi c xác đ nh v trí liên k t đơi d ng trans r t quan tr ng, nh chúng tơi đã trình bày trên trong khi axit vaccenic (trans-11-C18:1) cĩ v trí liên k t đơi d ng trans là 11 khơng gây h i t i s c kh e con ng i trong khi đĩ axit elaidic (trans- 9-C18:1) l i cĩ nh h ng r t x u t i s c kh e.
M t nh c đi m n a c a ph ng pháp FTIR: gi i h n đnh l ng th ng dao đ ng trong kho ng 5% đ i v i các n n m u là th c ph m.
2.3.2. S d ng k thu t s c ký khí (GC), [1, 12, 35]
Kh c ph c nh ng nh c đi m c a ph ng pháp FTIR, ph ng pháp s c ký khí phân tích đ c thành ph n các TFA, c ng nh v trí c a các liên đơi c a TFA.
S c ký khí là m t k thu t phân tích thơng d ng và hi u n ng cao, đ c s d ng đ phân tích nhi u lo i m u nh các đ c t , d c ph m, th c ph m, mơi tr ng…
Tuy nhiên do s c ký khí ch áp d ng đ i v i nh ng ch t d bay h i trong khi đĩ ch t béo ch y u là các triglycerit cĩ các axit béo hình thành 3 liên k t este v i phân t glycerol, th ng cĩ nhi t đ bay h i r t cao. Do đĩ đ nghiên c u thành ph n các axit béo cĩ trong d u m ta ph i th c hi n ph n ng chuy n ester (transesterification) v i ch t xúc tác cĩ th là axit ho c baz . B n ch t c a ph n ng chuy n este là tách phân t glycerol và thay th nĩ b ng các phân t metanol đ este hĩa các axit béo. Ta th y, khi dùng xúc tác là axit thì l ng axit d s gây h i cho các b ph n c b ng kim lo i. M t khác, vi c s d ng xúc tác là baz s di n ra nhanh h n, do đĩ mà các xúc tác KOH ho c NaOH th ng đ c s d ng nhi u h n khi x lý các lo i d u th c v t.
Trong các s n ph m t d u m luơn t n t i m t l ng axit béo t do, FFA, do đĩ mu n phân tích các thành ph n này, c ng c n t o d n xu t t FFA thành các h p ch t d bay h i m i phân tích đ c b ng s c ký khí. D i dây là các ph ng pháp d n xu t hĩa axit béo:
- Este hĩa v i xúc tác axit - Chuy n este b ng xúc tác bazo - Metyl este hĩa tr c ti p
- Ph ng pháp chi t- este hĩa đ ng th i s d ng thi t b vi sĩng đ h tr
Vào n m 2000, Carrapiso AI và các c ng s đã nghiên c u m t s ph ng pháp chi t và chuy n este tr c ti p khi phân tích các lipit. Các ph ng pháp chi t bao g m chi t b ng vi sĩng và chiet b ng ch t l ng siêu t i h n đ c so sánh v i ph ng pháp chuy n este tr c ti p. K t qu thu đ c cho th y ph ng pháp chuy n hĩa este tr c ti p cĩ đ chính xác cao và đáng tin c y, đ ng th i ti t ki m đ c hĩa ch t và th i gian phân tích.
2.3.3. Phân tích cis/trans FAMEs b ng cách s d ng b chi t pha r n ion B c SPE- ion Ag, [16, 40] ion Ag, [16, 40]
Nguyên lý ho t đ ng:
M u s đ c chi t qua b chi t pha r n SPE- ion Ag tr c khi đ c b m vào c t GC.
Trong c t SPE- ion Ag, các ion Ag s đ c g n lên các nhĩm ch c c a c t SXC SPE nh m t counter-ion. Khi m u FAME ch y qua cartridge, SCX- silver counter- ion ho t đ ng nh m t ch t nh n ion đ t o ra ph c phân c c v i các liên k t đơi c a các FAME ch a bão hịa. C ng đ c a t ng tác s t ng lên cùng v i s l ng các liên k t đơi, cịn các axit béo bão hịa ch gi l i r t y u. Các liên k t đơi cis th ng cĩ cĩ nh h ng v khơng gian m nh h n so v i các liên k t trans, do đĩ t o ra ph c h p cĩ đ phân c c m nh h n v i pha t nh. Do đĩ, các axit béo cis b gi l i trên c t chi t Ag- ion SPE lâu h n trans. M u sau đĩ đ c đem đi phân tích b ng GC-MS.
Tsuzuki W và Ushika( 2009) đã s d ng ph ng pháp chi t m u qua c t s c ký l ng pha đ o ( RP-HPLC) đ tách các đ ng phân cis-trans axit béo tr c khi đem đi phân tích GC, thay th cho ph ng pháp chi t qua c t ion b c. C t đ c s d ng trong ph ng pháp này là c t Cosmosil Cholester C18 ho c TSKgel ODS-100Z, pha đ ng là ACN. B ng vi c k t h p gi a RP-HPLC và GC, g n nh đã tách hồn tồn đ c các đ ng phân cis/trans C18:1. Hi u su t thu h i c a ph ng pháp đ t 98%.
2.3.4. Ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC), [22, 42]
Thơng th ng, khi phân tích các axit béo, ng i ta hay s d ng ph ng pháp GC. Tuy nhiên trong m t s tr ng h p đ c bi t, ph ng pháp HPLC l i t ra h u d ng. Ph ng pháp HPLC t ra hi u qu nh t là phân tích các axit d bay h i (các axit cĩ m ch ng n), ho c dùng đ nghiên c u ph ng pháp đ ng v đánh d u các axit béo. Các đ ng phân v trí hay đ ng phân c u hình cis, trans khi tách b ng HPLC c ng cho k t qu kh quan h n GC. Khi tách b ng HPLC cĩ th s d ng nhi u lo i detector khác nhau, nh ng đ i v i các ph ng pháp cĩ t o d n xu t thì detector UV và detector hu nh quanh đ c dùng ph bi n h n c . Ngày nay ng i ta c ng k t h p detector kh i ph v i HPLC đ cho k t qu phân tích chính xác h n.
- Quy trình
D n xu t hĩa: 1-2 µg axit béo và vài ng c a ch t n i chu n (C17: 0) đ c hịa tan trong m t th tích nh diclometan. H n h p sau đĩ đ c hút b ng micropipet vào ng
nghi m nh . Sau khi làm bay h i b ng khí nit , thêm 100 µl dung d ch làm vi c và 2- 4 mg Kali carbonat. Siêu âm nhanh, sau đĩ làm nĩng dung d ch 60oC trong 15 phút. Làm l nh dung d ch r i l c b i ph u l c nilon 0,22µm.
HPLC: S d ng c t C18 (250* 4 mm), b m gradient 2 kênh và detector hu nh quang v i b c sĩng kích thích và phát x l n l t là 325 nm và 398 nm. Dung d ch r a gi i A: ACN/ H2O (70/30, w/w); dung d ch B: ACN .Th tích b m m u : 20 µl.
C t ban đ u đ c r a gi i v i dung d ch A và thay đ i thành dung d ch ACN/H2O (95,5/4,5, v/v) t i phút th 24 trong vịng 10 phút. T c đ dịng là 1ml/phút.
2.4. LÝ THUY T V S C KÝ KHÍ GHÉP KH I PH (GC-MS), [2, 3, 4, 5, 14, 19, 20, 28, 36, 48]
2.4.1. S l c v s c ký khí
2.4.1.1. Khái ni m
S c ký khí là m t trong nh ng k thu t phân tích đ c ng d ng r ng rãi nh t hi n nay vì cĩ đ nh y và kh n ng đ nh l ng t t, phù h p đ xác đnh nhi u đ i t ng khác nhau. S c ký khí là m t ph ng pháp tách ch t trong đĩ pha đ ng là m t ch t khí (đ c g i là khí mang) và pha t nh ch a trong c t là m t ch t r n ho c ch t l ng ph trên b m t ch t mang tr d ng r n, hay ph đ u lên thành phía trong c t. Tùy thu c b n ch t pha t nh, ng i ta chia thành hai lo i s c ký khí:
+ N u pha t nh là m t ch t h p th r n thì k thu t phân tích đ c g i là s c ký khí- r n + N u pha t nh là m t ch t l ng đ c g n lên b m t c a ch t mang tr ho c đ c ph d i d ng m t l p phim m ng lên thành trong c a c t mao qu n thì k thu t này g i là s c ký khí- l ng.
Hình 2.9. Th i gian l u c a c u t phân tích trên s c ký đ