Thơng th ng, khi phân tích các axit béo, ng i ta hay s d ng ph ng pháp GC. Tuy nhiên trong m t s tr ng h p đ c bi t, ph ng pháp HPLC l i t ra h u d ng. Ph ng pháp HPLC t ra hi u qu nh t là phân tích các axit d bay h i (các axit cĩ m ch ng n), ho c dùng đ nghiên c u ph ng pháp đ ng v đánh d u các axit béo. Các đ ng phân v trí hay đ ng phân c u hình cis, trans khi tách b ng HPLC c ng cho k t qu kh quan h n GC. Khi tách b ng HPLC cĩ th s d ng nhi u lo i detector khác nhau, nh ng đ i v i các ph ng pháp cĩ t o d n xu t thì detector UV và detector hu nh quanh đ c dùng ph bi n h n c . Ngày nay ng i ta c ng k t h p detector kh i ph v i HPLC đ cho k t qu phân tích chính xác h n.
- Quy trình
D n xu t hĩa: 1-2 µg axit béo và vài ng c a ch t n i chu n (C17: 0) đ c hịa tan trong m t th tích nh diclometan. H n h p sau đĩ đ c hút b ng micropipet vào ng
nghi m nh . Sau khi làm bay h i b ng khí nit , thêm 100 µl dung d ch làm vi c và 2- 4 mg Kali carbonat. Siêu âm nhanh, sau đĩ làm nĩng dung d ch 60oC trong 15 phút. Làm l nh dung d ch r i l c b i ph u l c nilon 0,22µm.
HPLC: S d ng c t C18 (250* 4 mm), b m gradient 2 kênh và detector hu nh quang v i b c sĩng kích thích và phát x l n l t là 325 nm và 398 nm. Dung d ch r a gi i A: ACN/ H2O (70/30, w/w); dung d ch B: ACN .Th tích b m m u : 20 µl.
C t ban đ u đ c r a gi i v i dung d ch A và thay đ i thành dung d ch ACN/H2O (95,5/4,5, v/v) t i phút th 24 trong vịng 10 phút. T c đ dịng là 1ml/phút.
2.4. LÝ THUY T V S C KÝ KHÍ GHÉP KH I PH (GC-MS), [2, 3, 4, 5, 14, 19, 20, 28, 36, 48]
2.4.1. S l c v s c ký khí
2.4.1.1. Khái ni m
S c ký khí là m t trong nh ng k thu t phân tích đ c ng d ng r ng rãi nh t hi n nay vì cĩ đ nh y và kh n ng đ nh l ng t t, phù h p đ xác đnh nhi u đ i t ng khác nhau. S c ký khí là m t ph ng pháp tách ch t trong đĩ pha đ ng là m t ch t khí (đ c g i là khí mang) và pha t nh ch a trong c t là m t ch t r n ho c ch t l ng ph trên b m t ch t mang tr d ng r n, hay ph đ u lên thành phía trong c t. Tùy thu c b n ch t pha t nh, ng i ta chia thành hai lo i s c ký khí:
+ N u pha t nh là m t ch t h p th r n thì k thu t phân tích đ c g i là s c ký khí- r n + N u pha t nh là m t ch t l ng đ c g n lên b m t c a ch t mang tr ho c đ c ph d i d ng m t l p phim m ng lên thành trong c a c t mao qu n thì k thu t này g i là s c ký khí- l ng.
Hình 2.9. Th i gian l u c a c u t phân tích trên s c ký đ
a) Th i gian l u (tR)
Các c u t cĩ trong h n h p m u phân tích khi đ c n p vào c t s c ký ts t ng tác v i pha t nh và l u gi trên pha t nh m t th i gian nh t đnh g i là th i gian l u.
Th i gian l u c a 1 c u t đ c tính t lúc n p m u vào c t s c ký cho đ n lúc c u t này đ c r a gi i hồn tồn ra kh i c t, t i th i đi m đĩ ch t phân tích cĩ n ng đ c c đ i. Th i gian l u đ c tính theo cơng th c sau:
tR’ = tR- tO (3.1)
V i tR: th i gian l u c a c u t ch t phân tích (min) tR’: th i gian l u hi u ch nh (min)
tO: Th i gian đ cho m t ch t hồn tồn khơng cĩ ái l c v i pha t nh di qua c t, hay là th i gian pha đ ng đi vào c t đ n khi ra kh i c t, cịn g i là th i gian ch t (min). to cĩ th đ c tính g n đúng theo cơng th c sau
V dc L t 2 0 5 , 0 × × = (3.2) L: chi u dài c t, cm dc: đ ng kính c t, cm V: t c đ dịng pha đ ng, mL/phút
Cĩ th nh n danh c u t thơng qua th i gian l u vì trong cùng đi u ki n thí nghi m trên m t thi t b s c ký nh t đnh, th i gian l u c a ch t đĩ là m t đ i l ng xác đ nh.
b) H s dung l ng (k’): Cho bi t kh n ng phân b c a c u t c n phân tích trong
hai pha v i s c ch a c a c t. Nĩ c ng là t s gi a l ng ch t trong pha t nh và l ng ch t b kéo đi b i khí mang t i th i đi m cân b ng.
M S M M S S V V K V C V C k = × × × = ' o R o R t t t t t ' 0 = − = (3.3) Trong đĩ VS: th tích pha t nh M V : th tích pha đ ng S C : n ng đ c u t trong pha t nh M C : n ng đ c u t trong pha đ ng - '
k v a tùy thu c vào b n ch t c a ch t tan, b n ch t c a pha t nh c a c t và pha đ ng.
- k' ≈ 0: ch t ra r t nhanh, c t khơng cĩ kh n ng gi ch t l i. - '
k càng l n, th i gian phân tích càng kéo dài, m i cĩ kh n ng b dãn - r ng do ch t phân tích b gi lâu trong c t.
- Kho ng '
k lý t ng là 2÷5, nh ng khi phân tích m t h n h p ph c t p, - '
k cĩ th ch p nh n trong kho ng 1÷10.
c) ch n l c
ch n l c ( ) là đ i l ng bi u di n s khác nhau c a các m i k nhau trong m t h s c ký đã ch n. Khi càng khác 1 thì s tách c a hai ch t càng rõ.
ch n l c thay đ i theo s thay đ i c a thành ph n pha đ ng và pha t nh.
(3.4)
tách riêng 2 ch t, ta th ng ch n trong kho ng t 1 đ n 2, càng l n thì hai ch t càng tách nhau t t, nh ng khi quá l n thì th i gian phân tích s kéo dài, gây dỗng peak và t n kém khơng c n thi t.
Hình 2.8. Mơ t cách tính s đa lý thuy t
Là đ i l ng đ c tr ng cho hi u l c c a c t tách. S đa lý thuy t càng cao, kh n ng tách càng t t. N đ c tính theo cơng th c sau:
(3.5) V i Wb: b r ng đáy c a m i s c ký
W1/2: b r ng đáy c a m i s c ký phân n a chi u cao.
S đa lý thuy t càng l n và b r ng Wb càng nh thì m i s c ký càng nh n. Khi chi u cao c a c t khơng đ i, s đa lý thuy t t ng thì hi u n ng tách c a c t càng cao.
e) phân gi i (R): là đ i l ng đ c tr ng cho m c đ tach c a 2 ch t c nh nhau trên cùng m t đi u ki n s c ký. R đ c tính theo cơng th c sau:
N k k W W t t R B B B A A R B R S = 2×[ +− ]=14×⎛ −⎝⎜ 1⎞⎠⎟×⎛⎝⎜⎜ ' +1⎟⎟⎞⎠ ' ) ( ) ( α α (3.6) Trong đĩ tR1: Th i gian l u c a c u t th nh t TR2: Th i gian l u c a c u t th hai W1: B r ng đáy c a m i s c ký th nh t W2: B r ng đáy c a m i s c ký th hai : ch n l c c a c t s c ký cho hai c u t 1 và 2
Tr ng h p Rs= 1, hai m i cĩ đ l n t ng t nhau đ c phân tách kh i nhau kho ng 95%. cĩ th phân tích m t cách đnh l ng, hai m i k nhau ph i tách nhau hồn tồn, t c làRS ≥1,3. Khi Rs < 1,3 thì c n ph i thay đ i các thơng s th c nghi m đ làm t ngRS.
Tĩm l i, đ cĩ th phân tích đnh l ng b ng ph ng pháp s c ký khí thì c n ph i chú ý đ n kh n ng tách c a các m i trên s c ký đ . Tùy theo đi u ki n c th mà chúng
ta s t i u hĩa các thơng s th c nghi m c a pha đ ng (khí mang) c ng nh pha t nh (c t s c ký) cho h p ch t c n nghiên c u.
2.4.1.3. Thi t b s c ký khí
Hình 2.10. Mơ hình thi t b s c ký khí
Thi t b s c ký khí bao g m : 1. Khí mang (carrier gas) 2. Van tiêm m u (injector) 3. C t s c ký (Column) 4. u dị (Detector)
5. B ph n đi u khi n và x lý d li u (Data processor)
2.4.1.4. Nguyên t c ho t đ ng
M u đ c tiêm vào van tiêm m u. T i đây, m u đ c hĩa h i tr c khi đi vào dịng khí mang. Dịng khí mang đ c chuy n qua c t s c ký. D a vào kh n ng t ng tác c a nh ng c u t v i pha t nh mà chúng s đ c tách kh i nhau và đ c ghi nh n sau khi ra kh i c t b i đ u dị, t i đây n ng đ ch t đ c chuy n thành tín hi u đi n. Tín hi u này đ c khu ch đ i r i chuy n sang b ghi, tích phân k hay máy vi tính. Các tín hi u đ c x lý t i đĩ r i chuy n sang b ph n in và l u k t qu . K t qu c a quá trình phân tích s c ký khí đ c bi u di n b ng s c đ . Trên s c đ nh n đ c, s cĩ các tín hi u ng v i các c u t đ c tách g i là peak. M i peak c a s c đ ng v i m t hay m t nhĩm c u t c a m u phân tích.
S c ký khí cĩ th ghép v i nhi u lo i đ u dị khác nhau nh :đ u dị ion hĩa ng n l a (FID: Flame Ionization Detector), đ u dị d n nhi t (TCD: Thermal Conductivity Detector), đ u dị b t electron ho c cơng k t electron (ECD: Electron Capture Detector), đ u dị ion hĩa quang h c (PhotoIonization Detector), đ u dị quang k ng n l a (FPD),
đ u dị đo đ d n đi n hĩa (Hall Electrolytic Conductivity Detector), đ u dị kh i ph (MSD: Mass Spectrometer Detector). u dị thơng d ng ghép v i GC là FID, đ u dị này cĩ th cho phép phát hi n các axit béo n ng đ picogam.
Tuy nhiên nh c đi m c a trong phân tích b ng GC-FID đĩ là các axit béo đ c nh n danh b ng cách so sánh th i gian l u v i th i gian l u c a các ch t chu n, trong khi đĩ các ch t chu n axit béo cĩ gi i h n và thành ph n các axit béo r t ph c t p. Do đĩ s g p khĩ kh n trong vi c xác đnh m t s píc v i đ u dị FID
2.4.2. Ph ng pháp s c ký khí ghép kh i ph (GCMS)
Ph ng pháp kh i ph đ c áp d ng vào phân tích t nh ng n m 1940 cịn s c ký khí c ng đ c ra đ i s m nh ng vi c ghép n i gi a GC và MS đ c s d ng r ng rãi vào nh ng n m 1970 GC/MS. Ph ng pháp GC/MS ra đ i là m t ti n b khoa h c, v a phát huy đ c tính u vi t c a GC trong vi c tách ch t và đnh l ng, v a phát huy đ c kh n ng nh n bi t đ c m i c u t c a MS.
2.4.2.1. Nguyên lý ho t đ ng
Trong s c ký khí ghép kh i ph , h n h p ch t phân tích sau khi đ c tách ra kh i c t s đi qua m t đ ng truy n đ n đ u dị kh i ph . T i đây s di n ra quá trình ion hĩa. Ion sinh ra đ c t p trung và đ c đ a vào b ph n phân tích kh i l ng. M i ion phân tích s cĩ m t giá tr m/z xác đ nh, nh đĩ chúng đ c tách m t cách ch n l c ra kh i b phân tích kh i và t o tín hi u đ c tr ng t i h th ng phát hi n ion. B phân tích kh i cĩ th là m t t c c (GCMS), ba t c c (GCMS/MS), b y ion hay TOF…
2.4.2.2. Detector kh i ph (Mass spectrometry)
Kh i ph là thi t b phân tích d a trên c s xác đ nh kh i l ng phân t c a các h p ch t hĩa h c b ng vi c phân tách các ion phân t theo t s gi a kh i l ng và đi n tích (m/z) c a chúng. Các ion cĩ th t o ra b ng cách thêm hay b t đi n tích nh lo i b electron, proton hĩa,... Các ion t o thành này đ c tách theo t s m/z và phát hi n, t đĩ cĩ th cho thơng tin v kh i l ng ho c c u trúc phân t c a h p ch t.
C u t o c a m t thi t b kh i ph bao g m 3 ph n chính: ngu n ion, thi t b phân tích và detector. Tr c h t, các m u đ c ion hĩa trong ngu n ion, sau đĩ đ a vào b
ph n phân tích kh i đ tách các ion theo t s m/z. Các tín hi u thu đ c s chuy n vào máy tính đ x lý và l u tr .
Hình 2.11. S đ c u t o thi t b kh i ph 2.4.2.2.1. Các ki u ion hĩa trong GC-MS
Ch t phân tích sau khi ra kh i c t tách s đ c d n t i ngu n ion đ chuy n thành d ng h i và đ c ion hĩa nguyên t . M t s k thu t ion hĩa đ c s d ng trong s c ký l ng kh i ph nh : ion hĩa phun đi n t (electrospray ionization – ESI), ion hĩa hĩa h c áp su t khí quy n (atmospheric-pressure chemical ionization – APCI), ion hĩa b n phá nguyên t nhanh (fast-atom bombardment – FAB). D i đây là hai ph ng pháp ion hĩa th ng đ c s d ng trong phân tích GC-MS:
1. Ion hĩa phun đi n t – ESI
- Phân t ch t c n phân tích tr ng thái h i đ c đ a vào ngu n ion hĩa đ t nhi t đ cao (200-300oC). Electron t o ra t m t dây tĩc đ c nung nĩng (Filament), đ c gia t c lên 70 eV tr c khi vào bu ng ion hĩa. Nh ng electron đi vào bu ng ion hĩa và t ng tác v i các phân t trung hịa đ c đ a vào t c t s c ký, chúng s cung c p n ng l ng c n thi t đ tách m t đi n t phân l p ngồi c a phân t trung hịa, nh th s gi i phĩng m t electron và m t phân t g c t do mang đi n tích d ng. N ng l ng mà
Ngu n ion B phân tích kh i l ng B ph n
đi n t (electron) cung c p cho phân t trung hịa đ l n đ cĩ th phá v c u trúc ion d ng m i t o thành ra nh ng m nh ion mang đi n tích d ng nh h n đ ng th i gi i phĩng các phân t trung hịa hay g c t do.
M + e- å M*+. + 2e- M*+. å m+ + R*
M*+ å m*+ + R
Mơ t quá trình ion hĩa đi n t
2. Ion hĩa hĩa h c (Chemical Ionization)
- Ion hĩa hĩa h c d ng( Positive Chemical Ionization)
T ng t nh ion hĩa đi n t ngh a là v n s d ng dịng electron cĩ n ng l ng l n. i m khác bi t chính là khơng ion hĩa m u tr c ti p b ng dịng electron y mà thay vào đĩ ng i ta cho dịng electron này ion hĩa m t ch t khí (Reagent Gas: khí tác ch t) đ c đ a vào bu ng ion hĩa nh methane, ammoniac, ho c isobutane.
CH4 + e- å CH4+. + 2e- CH4+. å CH3+ , CH2+. … CH4+. + CH4 å CH5+ + CH3. CH3+ + CH4 å C2H5+ + H2 CH5+ + M å CH4 + MH+ Hình 2.12. Ion hĩa đi n t
Quá trình ion hĩa này di n ra nhanh trong bu ng ion hĩa t o ra t khí thêm vào các phân t ion mang đi n tích d ng b n trong mơi tr ng Plasma methane nh CH5+, C2H5+. Ng i ta g i chúng là nh ng ion tác ch t (reagent ion). Nh ng ion này là acid Bronsted m nh, chúng s ion hĩa các phân t ch t phân tích thành ion d ng b ng cách nh ng m t proton.
Hình 2.14. Ion hĩa hĩa h c d ng t o ion d ng t ch t phân tích
Khơng gi ng nh ion hĩa đi n t , các ion d ng sinh ra MH+ b n h n vì n ng