Quá trình lên men 荏 nhi羽v"8瓜 cao có nhi隠w"逢w"vj院 pj逢"t嘘e"8瓜 lên men nhanh, gi違m chi phí h羽 th嘘ng làm mát, gi違m vi khu育n t衣p nhi宇m, có th吋 泳ng d映ng quá trình
8逢運pi"j„c"x "n‒p"ogp"8欝ng th運i [20]0"Fq"8„."p医m men ch鵜u nhi羽v"8cpi"8逢嬰c nghiên c泳u, kh違o sát kh違p<pi"泳ng d映ng 荏 nhi隠w"p逢噂c trên th院 gi噂i, vtqpi"8„"e„"p逢噂c ta. Tuy nhiên, các báo cáo v隠 n医m men ch鵜u nhi羽t v磯n còn trên qui mô phòng thí nghi羽m. Ch雨
có m瓜t s嘘n逢嬰ng h衣n ch院 các nghiên c泳u thành công v隠 vi羽c l詠a ch丑n và phân l壱p các gi嘘ng n医m men có kh違 p<pi"v<pi"vt逢荏ng, lên men 荏 40oC ho員e"ecq"j挨p0 Vì v壱y, vi羽c
泳ng d映ng n医m men ch鵜u nhi羽t vào qui mô công nghi羽p v磯n còn h衣n ch院. M瓜t s嘘 gi嘘ng n医m men ch鵜u nhi羽v" 8«" x " 8cpi" 8逢嬰c nghiên c泳w" pj逢<"S. cerevisae, K. maxcianus, Pichia kudriavzevii, Hansenula polymorpha, Debaromyces hansenii, I. orientalis, C.glabrataÈVtqpi" 8„" p鰻i b壱t nh医t là S. cerevisae, K. maxcianus và Pichia kudriavzevii.
14
S. cerevisae là gi嘘ng 8逢嬰c s穎 d映ng nhi隠u nh医t trong qui mô công nghi羽p. So v噂i các gi嘘ng khác thì S. cerevisae có nhi隠w"逢w"vj院j挨p"pj逢<"e„"kh違p<pi"n‒p"ogp"ecq. tiêu th映8逢運pi"pjcpj"j挨p."ít s違n ph育m ph映, s違p"n逢嬰pi"gvjcpqn"ecq"j挨p"x "ej鵜w"8逢嬰c n欝ng
8瓜gvjcpqn"ecq"j挨p0"Piq k"tc"S. cerevisae còn an toàn trong công nghi羽p th詠c ph育m và
p逢噂c gi違i khát. Tuy nhiên kh違 p<pi"ej鵜u nhi羽t c栄a S. cerevisae l衣i kém. Ngay c違 các gi嘘ng S. cerevisae 8逢嬰c phân l壱p t瑛 các vùng nhi羽v"8噂i ch雨 có th吋n‒p"ogp"8逢嬰c 荏 nhi羽t
8瓜 cao nh医t là 41oC [11̲0"Fq"8„." 8吋 n o"v<pi"mj違 p<pi" ej鵜u nhi羽t c栄a S. cerevisae
vj逢運ng s穎 d映ng eƒe"rj逢挨pi"rjƒr"i¤{"8瓜t bi院n ho員c tái t鰻 h嬰p gene.
Hi羽n nay, K. marxianus 8cpi"8逢嬰c quan tâm nghiên c泳u, có nhi隠u tri吋n v丑ng thay th院 cho S.cerevisae. Nhi隠u gi嘘ng K. marxianus có th吋 phát tri吋n 荏 nhi羽v"8瓜 cao 45
Î 52oC, và lên men ethanol 荏 38 Î 45oC. J挨p n英a, K. marxianus còn có t嘘e"8瓜 v<pi" vt逢荏ng cao và lên men nhi隠u lo衣k"8逢運ng (arabinose, galactose, mannose, xylose). Tuy nhiên, các so sánh v隠 h羽 th嘘pi"vtcq"8鰻i ch医t gi英a K. marxianus và S. cerevisae còn
ej逢c"8亥{"8栄. Vì th院 K. marxianus v磯n ch雨 8逢嬰c s穎 d映ng trong các nghiên c泳u v隠 lên men ph映 ph育m công nghi羽r"pj逢"d«"o c."pi»."vtƒk"e¤{."o壱t r雨8逢運piÈ[29].
G亥p"8¤{."thêm m瓜t s嘘 gi嘘ng n医m men ch鵜u nhi羽t m噂k"8逢嬰c phân l壱p x "8cpi" 8逢嬰c nghiên c泳w" pj逢" Debaryomyces hansenii [30], Pichia kudriavzevii [16], Issatchenkia orientalis [24̲ÈVtqpi"8„"ik嘘ng Pichia kudriavzevii có ti隠o"p<pi"n噂n cho các 泳ng d映ng vào qui mô công nghi羽p. Gi嘘ng này, có kh違 p<pi"n‒p"ogp"荏 42oC, v噂i s違p"n逢嬰ng ethanol có th吋 lên t噂i 85% trên m厩i g glucose. Ngoài ra, Pichia kudriavzevii còn có th吋 n‒p"ogp"8逢運ng pentose, các t院 bào Pichia kudriavzevii có th吋 tái s穎 d映ng cho 4 l亥n lên men mà không gi違o"8ƒpi"m吋 ho衣t tính lên men [28].
15
Ej逢挨pi"50 N浦K"FWPI"XÉ"RJ姶愛PI"RJèR"PIJKçP"E永U
3.1. N瓜i dung c栄c"8隠 tài
‚ Phân l壱p n医m men có kh違p<pi"ch鵜u nhi羽t 8吋 b鰻 sung vào ngu欝n gi嘘ng cho các quá trình lên men.
‚ A鵜pj"fcpj"u挨"d瓜 n医m men phân l壱p.
‚ Kh違o sát ho衣t tính lên men c栄a các gi嘘ng n医m men phân l壱p.
‚ Xây d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng c栄a gi嘘ng n医m men có ho衣t tính lên men cao nh医t.
3.2. Nguyên li羽u và hóa ch医t 3.2.1. Nguyên li羽u
3.2.1.1. Ngu欝n nguyên li羽u
‚ Ngu欝n vi sinh v壱t t詠 nhiên
- P逢噂c mía.
- Các lo衣k"vtƒk"e¤{"8逢嬰c thu mua t瑛 ch嬰荏 thành ph嘘 H欝 Chí Minh: nho, m壱p."f逢c"j医u, táo, xoàiÈ
‚ M»k"vt逢運ng lên men: m映e"8 ej"vj "pijk羽m nh茨m kh違o sát kh違 p<pi"n‒p" ogp"vtqpi"o»k"vt逢運ng th詠c t院 là d鵜ch nho có n欝pi"8瓜 ch医t khô 20o Brix, pH 4.0, có b鰻 sung thành ph亥n (NH4)2HPO4 195 ppm, và NaHSO3 112 ppm.
3.2.1.2. X穎 lý nguyên li羽u
‚ Ngu欝n vi sinh v壱t t詠 nhiên
Các nguyên li羽u sau khi thu mua v隠8逢嬰c x穎n#"u挨"d瓜: r穎a s衣ej."8吋 tƒq0"Ucw"8„"
xay b茨ng máy xay sinh t嘘. Nguyên li羽w"ucw"mjk"zc{"8逢嬰c cho vào các erlen lo衣i 250
on."8壱y kín b茨ng nút bông không th医o"p逢噂c. Cho các erlen có ch泳a nguyên li羽u vào t栄 医m, 栄荏 40oC trong kho違ng 3 ngày. Dung d鵜ej"p {"8逢嬰c s穎 d映pi"8吋 phân l壱p n医m men ch鵜u nhi羽t b茨pi"rj逢挨pi"rjƒr"f p"8隠u và c医y ria vt‒p"8 c"rgvtk0
‚ M»k"vt逢運ng lên men
Gi嘘ng nho s穎 d映ng là nho Syrah Ninh Thu壱n. Nho sau khi thu mua v隠, 8逢嬰c x穎 n#"u挨"d瓜."ucw"8„ ép l医y d鵜ch r欝i tr英8»pi"8吋 dùng trong su嘘t quá trình thí nghi羽m. D鵜ch
16
pjq"vt逢噂c khi s穎 d映pi"8逢嬰e"t«"8»pi"x "thanh trùng b茨ng NaHSO3 112 ppm. Qui trình
fir"pjq"8逢嬰c ti院p"j pj"pj逢"ucw< Hình 3.1. Qui trình x穎 lý d鵜ch nho Gia nhi羽t 70oC, 5 phút Tách cu嘘ng L丑e"u挨"d瓜 Ép X穎 lý enzyme 45 Î 50oC, 120 phút R穎a D鵜ch nho Pectinase 0.1% Gi医y l丑c Nho
17 3.2.2. Hóa ch医t Hóa ch医t Xu医t x泳 Glucose Trung Qu嘘c Lactose Saccharose Maltose Xylose Galactose NaOH NaHSO3 (NH4)2SO4 Agar Pepton Cao n医m men Cao malt Natri Acetate Kali Nitrate Urea Acid citric Xanh methylene Bromthymol blue Phenol red
18
3.3. U挨"8欝 nghiên c泳u
Eƒe"ikck"8q衣n nghiên c泳w"8逢嬰e"vt·pj"d {"vjgq"u挨"8欝 sau:
Hình 3.2. U挨"8欝 nghiên c泳u Gi英 gi嘘ng Phân l壱p Qu亥n th吋 vi sinh v壱t t詠 nhiên A員c 8k吋m sinh lý sinh hóa Kh違 p<pi" ch鵜u nhi羽t A鵜nh danh u挨"d瓜 n医m men Nghiên c泳u A員c 8k吋m hình thái Ho衣t tính lên men
Kh違o sát quá trình lên men
Lên men các lo衣i
19
3.4. Thi院t b鵜 và d映ng c映
3.4.1. Chu育n b鵜
‚ Oƒ{"8q"rJ8吋 bàn
‚ Máy ép trái cây
‚ Máy xay sinh t嘘
‚ N欝i h医p ‚ N欝i ti羽t trùng ‚ Máy l逸c Vortex ‚ T栄 s医y ‚ B吋8k隠u nhi羽t ‚ E¤p"8k羽n t穎 ‚ T栄医m ‚ Kính hi吋n vi quang h丑c ‚ T栄 c医y ‚ Brix k院 c亥m tay
‚ 渦ng nghi羽m, petri, gtngp."dgejgt."rkrgvÈ
3.4.2. Ti羽t trùng d映ng c映x "o»k"vt逢運ng làm vi羽c [2] 3.4.2.1. B隠 m員v"x "o»k"vt逢運ng làm vi羽c
- C穎a s鰻 ra vào ph違k"8逢嬰e"8„pi"vt逢噂c th運k"8k吋m làm vi羽c. - Kh穎 trùng b隠 m員t b茨ng c欝n 70o.
- A嘘i v噂i t栄 c医y, sau khi lau b茨ng c欝n 70o, b壱v"8flp"WX"trong kho違ng 15 phút.
3.4.2.2. D映ng c映 làm vi羽c
- Vt逢噂c khi ti羽t trùng, các d映ng c映 c亥p"8逢嬰c làm s衣ch và s医y khô.
- Các d映ng c映 c亥p"8逢嬰c gói kín trong gi医y b衣c ho員e"8壱y kín h瓜r"8吋8違m b違o sau khi ti羽t trùng, d映ng c映 không b鵜 nhi宇m l衣i t瑛o»k"vt逢運ng bên ngoài.
- 渦ng nghi羽m th栄y tinh c亥n ph違k"8壱y b茨ng bông không th医o"p逢噂c. - H瓜p petri c亥p"8逢嬰c gói trong gi医y.
- Rkrgv."swg"vtcpi."8 c"vj栄{"vkpjÈ"p院u c亥n ti羽t trùng c亥n ph違i gói vào gi医y b衣c. - A亥u micropipet b茨ng nh詠a ch鵜u nhi羽t ph違k"8逢嬰e"8壱y trong h瓜p kín.
20
3.5. Các lo衣k"o»k"vt逢運ng nghiên c泳u [2, 7, 23] 3.5.1. M»k"vt逢運ng Jcpugp"8員c (MT1)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: glucose 50 g, pepton 10 g, agar 20 g, KH2PO4 3 g,
p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Hòa tan các thành ph亥p"o»k"vt逢運ng x q"gtngp."8鵜nh m泳e"p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Cho vào b吋8k隠u nhi羽t 荏 80oC ejq"8院p"mjk"o»k"vt逢運ng trong su嘘t (kho違ng 1h). - H医p ti羽v"vt́pi"o»k"vt逢運ng 荏 121oC trong vòng 15 Î 20 phút. A鰻 o»k"vt逢運ng
x q"eƒe"8 c"rgvtk"8«"8逢嬰c ti羽t trùng.
- Ucw"mjk"o»k"vt逢運pi"8»pi8員e."¿r"pi逢嬰e"eƒe"8 c"rgvtk, gói kín b茨ng gi医y. - Ejq"eƒe"8 c"rgvtk"x q"v栄医m, 栄荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 1 tu亥n.
- A吋 làm các 嘘ng th衣ch nghiêng: phân b嘘 o»k" vt逢運ng vào các 嘘ng nghi羽m, kho違ng 1/4 chi隠u cao 嘘ng nghi羽m. H医p ti羽t trùng 嘘ng nghi羽m có o»k"vt逢運ng 荏
121oC trong vòng 15 Î 42"rj¿v0"Ucw"8„"8員t nghiêng các 嘘ng th衣ch. Các 嘘ng th衣ej"pijk‒pi"ucw"mjk"8»pi"8員e"8逢嬰c cho vào t栄医m, 栄荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 1 tu亥n.
- Ki吋o"vtc"eƒe"8 c"rgvtk."eƒe"嘘ng th衣ch nghiêng sau khi 栄. Ti羽t trùng b臼 eƒe"8 c
petri, 嘘ng th衣ch nghiêng b鵜 nhi宇m vi sinh v壱t, ch雨 s穎 d映pi"eƒe"8 c"rgvtk."嘘ng th衣ch nghiêng không b鵜 nhi宇m.
3.5.2. O»k"vt逢運ng Hansen l臼ng (MT2)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: gi嘘ng o»k"vt逢運ng OV3"pj逢pi"mhông có agar.
- Hòa tan các thành ph亥p"o»k"vt逢運pi"x q"gtngp."8鵜nh m泳c p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Cho vào b吋8k隠u nhi羽t 荏 80oC kho違ng 15 phút. - Phân b嘘 10 on"o»k"vt逢運ng vào các 嘘ng nghi羽m. - A壱y kín b茨ng nút bông không th医o"p逢噂c.
- H医p ti羽t trùng 嘘pi"o»k"vt逢運ng 荏 121oC trong vòng 15 Î 20 phút.
3.5.3. O»k"vt逢運ng nhân gi嘘ng (MT3)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: cao n医m men 1 g, glucose 50 g, pepton 10 g, KH2PO4 3 i."p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
21
3.5.4. O»k"vt逢運ng th衣ch Îp逢噂c (MT4)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: glucose 1 g, agar 20 g, Natri acetate 1.4 g, p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Chu育n b鵜eƒe"8 c"o»k"vt逢運pi"v逢挨pi"v詠o»k"vt逢運ng MT1.
3.5.5. O»k"vt逢運ng OF-Glucose (MT5)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: glucose 10 g, pepton 2 g, NaCl 5 g, KH2PO4 0.3 g,
p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Hòa tan các thành ph亥n môi vt逢運pi"x q"gtngp."8鵜nh m泳e"p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000
ml.
- Cho vào b吋8k隠u nhi羽t 荏 80oC kho違ng 15 phút.
- Ejq"x q"o»k"vt逢運ng 3 ml dung d鵜ch bromthymol blue 1%.
- Phân b嘘 10 on"o»k"vt逢運ng vào các 嘘ng nghi羽m.
- Cho 嘘pi"fwtjco"¿r"pi逢嬰c vào 嘘ng nghi羽m.
- A壱y kín 嘘ng nghi羽m b茨ng bông không th医o"p逢噂c.
- Ti羽t trùng các 嘘pi"o»k"vt逢運ng 荏 121oC trong vòng 15 Î 20 phút.
3.5.6. O»k"vt逢運ng th穎 kh違p<pi"n‒p"ogp"ngu欝n carbon (MT6)
- S穎 d映ng d鵜ch chi院v"ikƒ"8壱u: cân 200 i"ikƒ"8壱u, r穎a s衣ej."8吋 ráo. B鰻 sung 1 l
p逢噂e0"Awp"u»k"vtqpi"52"rj¿v0"N丑c l医y ph亥n d鵜ch trong r欝k"vj‒o"p逢噂c c医v"8鵜nh m泳c v瑛c"8栄 1000 ml.
- B鰻 sung 5% các lo衣k" 8逢運ng c亥n kh違o sát: glucose, galactose, xylose, saccharose, maltose, lactose.
- Phân b嘘 10 on"o»k"vt逢運pi"e„"8逢運ng c亥n kh違o sát vào các 嘘ng nghi羽m. - Cho 嘘pi"fwtjco"¿r"pi逢嬰c vào 嘘ng nghi羽m.
- A壱y kín 嘘ng nghi羽m b茨ng bông không th医o"p逢噂c.
- Ti羽t trùng các 嘘pi"o»k"vt逢運ng 荏 121oC trong vòng 15 Î 20 phút.
3.5.7. O»k"vt逢運ng Christensen (MT7)
- Thành ph亥p" o»k" vt逢運ng: pepton 1 g, glucose 5 g, agar 20 g, NaCl 5 g, KH2PO4, p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Hòa tan các thành ph亥p"o»k"vt逢運pi"x q"gtngp."8鵜nh m泳e"p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
22
- Ejq"x q"o»k"vt逢運ng 6 ml dung d鵜ch phenol red 0.2%.
- A吋 làm các 嘘ng th衣ch nghiêng nitrate: b鰻 sung Kali nitrate (1%) vào môi
vt逢運ng. Phân b嘘 o»k"vt逢運ng vào các 嘘ng nghi羽m, kho違ng 1/4 chi隠u cao 嘘ng nghi羽m. H医p ti羽t trùng 嘘ng nghi羽o"e„"o»k"vt逢運ng 荏 121oC trong vòng 15 Î 20
rj¿v0"Ucw"8„"8員t nghiêng các 嘘ng th衣ch. Các 嘘ng th衣ej"pijk‒pi"ucw"mjk"8»pi" 8員e"8逢嬰c cho vào t栄医m, 栄荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 1 tu亥n.
- A吋 làm các 嘘ng th衣ch nghiêng urea: h医p ti羽v"vt́pi"o»k"vt逢運ng MT7 荏 121oC trong vòng 15 Î 20 phút. Làm ngu瓜k"o»k"vt逢運ng v隠 80oC b茨ng b吋 8k隠u nhi羽t.
Ucw"8„"d鰻 sung 100 ml dung d鵜ej"wtgc"42'"8«"mj穎 trùng b茨ng UV. Phân b嘘 o»k"vt逢運ng vào các 嘘ng nghi羽m, kho違ng 1/4 chi隠u cao 嘘ng nghi羽m. Ucw"8„"8員t nghiêng các 嘘ng th衣ch. Các 嘘ng th衣ej"pijk‒pi"ucw"mjk"8»pi"8員e"8逢嬰c cho vào t栄医m, 栄荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 1 tu亥n.
- Ki吋m tra các 嘘ng th衣ch nghiêng sau khi 栄. Ti羽t trùng b臼 các 嘘ng b鵜 nhi宇m vi sinh v壱t, ch雨 s穎 d映ng các 嘘ng không b鵜 nhi宇m.
3.5.8. O»k"vt逢運ng th穎 kh違p<pi"phân gi違i tinh b瓜t (MT8)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: meat extract 3 g, pepton 10 g, tinh b瓜t hòa tan 10 g, agar 20 i."p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Chu育n b鵜eƒe"8 c"o»k"vt逢運pi"v逢挨pi"v詠pj逢"o»k"vt逢運ng MT1.
3.5.9. O»k"vt逢運ng th穎 kh違p<pi"j„c"n臼ng gelatin (MT9)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: gelatin 100 g, pepton 10 i."p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Chu育n b鵜 các 嘘ng th衣ej"v逢挨pi"v詠pj逢"o»k"vt逢運ng MT1.
3.5.10.O»k"vt逢運ng 50% glucose (MT10)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: cao men 1 g, agar 20 g, glucose 500 i."p逢噂c c医t v瑛a
8栄 1000 ml.
- Chu育n b鵜 các 嘘ng th衣ej"pijk‒pi"v逢挨pi"v詠 pj逢"o»k"vt逢運ng MT1.
3.5.11.O»k"vt逢運ng 5% glucose, 10% NaCl (MT11)
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: cao men 1 g, glucose 50 g, NaCl 100 g, agar 20 g,
p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1000 ml.
- Chu育n b鵜 các 嘘ng th衣ej"pijk‒pi"v逢挨pi"v詠 pj逢"o»k"vt逢運ng MT1.
3.5.12.O»k"vt逢運ng lên men (MT12)
23
- Ch雨nh pH v隠 4.0 b茨ng dung d鵜ch NaOH 1M. - B鰻uwpi"inwequg"8院n 20o Brix.
- B鰻 sung (NH4)2HPO4 195 ppm, NaHSO3 112 ppm. - Phân b嘘42"on"o»k"vt逢運ng vào các 嘘ng nghi羽m. - A壱y kín b逸ng nút bông.
3.5.13.O»k"vt逢運ng pha loãng m磯u
- Thành ph亥p"o»k"vt逢運ng: NaCl 9 g, p逢噂c c医t v瑛c"8栄 1 l.
- Chu育n b鵜 o»k"vt逢運ng v逢挨pi"v詠 o»k"vt逢運ng MT2. 渦ng nghi羽m có ch泳a 9 ml
o»k"vt逢運ng.
3.6. Các thí nghi羽m
3.6.1. Phân l壱p, t衣o gi嘘ng thu亥n khi院t và gi英 gi嘘ng [2] 3.6.1.1. Nguyên t逸c 3.6.1.1. Nguyên t逸c
Tách r運i m瓜t lo衣i t院 bào t瑛 qu亥n th吋 vi sinh v壱v"dcp"8亥w."ucw"8„"ikgq"e医{"vt‒p"8 c"
petri v噂k"o»k"vt逢運pi"fkpj"f逢叡ng ch丑n l丑c và 栄 荏 8k隠u ki羽n thích h嬰p. M厩i t院 bào s胤
hình thành nên m瓜t khu育n l衣c riêng bi羽t.
3.6.1.2. Phân l壱p
- Các m磯u nguyên li羽u sau khi 栄 荏 40oC trong kho違ng 3 ngày, l詠a ch丑n nh英ng m磯u có d医u hi羽w"ukpj"vt逢荏ng: sinh b丑t khí, n鰻k"xƒpiÈ8吋 phân l壱p.
- Hút 0.1 ml dung d鵜ch b茨pi" oketqrkrgv" ejq" x q" eƒe" 8 c" rgvtk" e„" ej泳a môi
vt逢運pi"OV30"Ucw"8„"f p"8隠u b茨pi"swg"vtcpi"8«"vk羽t trùng.
- òr"pi逢嬰e"eƒe"8 c"rgvtk"e„"ej泳a m磯u và cho vào t栄医m 栄荏 40oC trong kho違ng 3 ngày. Ucw"8„"ej丑n các khu育n l衣c nghi ng運 là n医m men, làm tiêu b違n quan sát
f逢噂i kính hi吋n vi, v壱t kính x42."8瓜rj„pi"8衣i 400 l亥n.
- Mjk"8«"zƒe"8鵜pj"8逢嬰c n医m men, c医y ria nhi隠u l亥p"vt‒p"8 c"rgvtk"e„"o»k"vt逢運ng MT1 8吋 làm thu亥n.
3.6.1.3. Gi英 gi嘘ng
- Sau mjk"e„"8逢嬰c gi嘘ng thu亥n khi院t, c医y gi嘘pi"n‒p"o»k"vt逢運ng th衣ch nghiêng MT1, 栄荏 nhi羽v"8瓜 phòng.
- Sau 3 ngày quan sát s詠ukpj"vt逢荏ng c栄a khu育n l衣c.
- Ch丑n nh英ng 嘘pi"ukpj"vt逢荏ng t嘘t, không b鵜 nhi宇m, c医t gi英 荏 4 Î 5oC trong t栄
24
- C医y truy隠p"8鵜nh k vt‒p"o»k"vt逢運ng th衣ch nghiêng MT1 kho違ng 1 tháng/l亥n.
3.6.2. Swcp"uƒv"8員e"8k吋m hình thái [7]
3.6.2.1 Quan sát hình thái khu育n l衣c, t院 bào
- Nuôi c医{"vt‒p"eƒe"8 c"rgvtk"e„"ej泳c"o»k"vt逢運ng MT1 trong kho違ng 3 ngày. - Swcp"uƒv"8員e"8k吋m khu育n l衣c: hình d衣ng, màu s逸c, l欝i hay lõm, rìa khu育n l衣eÈ
- Quan sát hình d衣ng t院 bào: làm tiêu b違p"swcp"uƒv"f逢噂i kính hi吋n vi, 8瓜 phóng
8衣i 400 l亥n.
- K悦 thu壱t làm tiêu b違n:
‚ Chu育n b鵜 lame kính và lame men s衣ch.
‚ Nh臼 m瓜t gi丑v"p逢噂c vô khu育n lên lame kính.
‚ J挨"8臼 que c医y, làm ngu瓜i, sau 8„"n医y 1 ph亥n nh臼 sinh kh嘘i n医m men lên que c医y.
‚ Tr瓜p"8隠u sinh kh嘘i n医m men vào gi丑v"p逢噂e"x "f p"8隠u gi丑v"p逢噂c trên lame kính.
‚ A壱{"ncog"ogp"n‒p."8吋 yên 2 - 3 phút, r欝k"8go"swcp"uƒv0
‚ A吋 phân bi羽t t院 bào s嘘ng, ch院t, s穎 d映ng thu嘘c nhu瓜m xanh methylene.
‚ A吋 quan sát 荏8瓜 rj„pi"8衣i 1000 l亥n, s穎 d映ng v壱t kính d亥u x100.
3.6.2.2 Quan sát quá trình n違y ch欝i
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào 嘘ng nghi羽m có ch泳c"o»k"vt逢運ng MT2. Nuôi c医y 荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 2 - 3 ngày.
- Ucw"8„"n医y m磯u làm tiêu b違n quan sát f逢噂i kính hi吋n vi, 8瓜rj„pi"8衣i 400 l亥n. - Swcp"uƒv"eƒe"8員e"8k吋m:
‚ N医m men n違y ch欝i hay phân c逸t t院 bào.
‚ N院u n医m men n違y ch欝k"vj·"zƒe"8鵜nh v鵜 trí n違y ch欝i (t衣i c詠c hay b医t kì v鵜 trí nào).
3.6.2.3 Quan sát bào t穎
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻k"x q"8 c"rgvtk"e„ ch泳c"o»k"vt逢運ng MT4. Nuôi c医y 荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 5 - 10 ngày.
- Ucw"8„"n o"vk‒w"d違p"uqk"v逢挨k"f逢噂i kính hi吋n vi, 8瓜 rj„pi"8衣i 400 l亥n, r欝i 8瓜 rj„pi"8衣i 1000 l亥n.
25
‚ N医m men có hình thành bào t穎 hay không.
‚ N院u có, xƒe"8鵜nh hình d衣ng và s嘘n逢嬰ng bào t穎 n医m men.
3.6.3. Kh違q"uƒv"eƒe"8員c tính sinh lý sinh hóa [7] 3.6.3.1. Chu育n b鵜 gi嘘ng 3.6.3.1. Chu育n b鵜 gi嘘ng
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào 嘘ng nghi羽m có ch泳c"o»k"vt逢運ng MT4. Nuôi c医y 荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong 48h.
- Ucw" 8„" zƒe" 8鵜nh m壱v" 8瓜 t院 bào b茨pi" rj逢挨pi" rjƒr" 8院m tr詠c ti院p, s穎 d映ng bu欝pi"8院m Thoma lo衣i 1/400 mm2.
3.6.3.2. Kh違p<pi"ej鵜u nhi羽t
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻k"x q"eƒe"8 c"rgvtk"e„"ej泳c"o»k"vt逢運ng