3.6.1. Phân l壱p, t衣o gi嘘ng thu亥n khi院t và gi英 gi嘘ng [2] 3.6.1.1. Nguyên t逸c 3.6.1.1. Nguyên t逸c
Tách r運i m瓜t lo衣i t院 bào t瑛 qu亥n th吋 vi sinh v壱v"dcp"8亥w."ucw"8„"ikgq"e医{"vt‒p"8 c"
petri v噂k"o»k"vt逢運pi"fkpj"f逢叡ng ch丑n l丑c và 栄 荏 8k隠u ki羽n thích h嬰p. M厩i t院 bào s胤
hình thành nên m瓜t khu育n l衣c riêng bi羽t.
3.6.1.2. Phân l壱p
- Các m磯u nguyên li羽u sau khi 栄 荏 40oC trong kho違ng 3 ngày, l詠a ch丑n nh英ng m磯u có d医u hi羽w"ukpj"vt逢荏ng: sinh b丑t khí, n鰻k"xƒpiÈ8吋 phân l壱p.
- Hút 0.1 ml dung d鵜ch b茨pi" oketqrkrgv" ejq" x q" eƒe" 8 c" rgvtk" e„" ej泳a mơi
vt逢運pi"OV30"Ucw"8„"f p"8隠u b茨pi"swg"vtcpi"8«"vk羽t trùng.
- òr"pi逢嬰e"eƒe"8 c"rgvtk"e„"ej泳a m磯u và cho vào t栄医m 栄荏 40oC trong kho違ng 3 ngày. Ucw"8„"ej丑n các khu育n l衣c nghi ng運 là n医m men, làm tiêu b違n quan sát
f逢噂i kính hi吋n vi, v壱t kính x42."8瓜rj„pi"8衣i 400 l亥n.
- Mjk"8«"zƒe"8鵜pj"8逢嬰c n医m men, c医y ria nhi隠u l亥p"vt‒p"8 c"rgvtk"e„"o»k"vt逢運ng MT1 8吋 làm thu亥n.
3.6.1.3. Gi英 gi嘘ng
- Sau mjk"e„"8逢嬰c gi嘘ng thu亥n khi院t, c医y gi嘘pi"n‒p"o»k"vt逢運ng th衣ch nghiêng MT1, 栄荏 nhi羽v"8瓜 phòng.
- Sau 3 ngày quan sát s詠ukpj"vt逢荏ng c栄a khu育n l衣c.
- Ch丑n nh英ng 嘘pi"ukpj"vt逢荏ng t嘘t, không b鵜 nhi宇m, c医t gi英 荏 4 Ỵ 5oC trong t栄
24
- C医y truy隠p"8鵜nh k vt‒p"o»k"vt逢運ng th衣ch nghiêng MT1 kho違ng 1 tháng/l亥n.
3.6.2. Swcp"uƒv"8員e"8k吋m hình thái [7]
3.6.2.1 Quan sát hình thái khu育n l衣c, t院 bào
- Nuôi c医{"vt‒p"eƒe"8 c"rgvtk"e„"ej泳c"o»k"vt逢運ng MT1 trong kho違ng 3 ngày. - Swcp"uƒv"8員e"8k吋m khu育n l衣c: hình d衣ng, màu s逸c, l欝i hay lõm, rìa khu育n l衣eÈ
- Quan sát hình d衣ng t院 bào: làm tiêu b違p"swcp"uƒv"f逢噂i kính hi吋n vi, 8瓜 phóng
8衣i 400 l亥n.
- K悦 thu壱t làm tiêu b違n:
‚ Chu育n b鵜 lame kính và lame men s衣ch.
‚ Nh臼 m瓜t gi丑v"p逢噂c vơ khu育n lên lame kính.
‚ J挨"8臼 que c医y, làm ngu瓜i, sau 8„"n医y 1 ph亥n nh臼 sinh kh嘘i n医m men lên que c医y.
‚ Tr瓜p"8隠u sinh kh嘘i n医m men vào gi丑v"p逢噂e"x "f p"8隠u gi丑v"p逢噂c trên lame kính.
‚ A壱{"ncog"ogp"n‒p."8吋 yên 2 - 3 phút, r欝k"8go"swcp"uƒv0
‚ A吋 phân bi羽t t院 bào s嘘ng, ch院t, s穎 d映ng thu嘘c nhu瓜m xanh methylene.
‚ A吋 quan sát 荏8瓜 rj„pi"8衣i 1000 l亥n, s穎 d映ng v壱t kính d亥u x100.
3.6.2.2 Quan sát quá trình n違y ch欝i
- C医y 1 vịng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào 嘘ng nghi羽m có ch泳c"o»k"vt逢運ng MT2. Ni c医y 荏 nhi羽v"8瓜 phịng trong kho違ng 2 - 3 ngày.
- Ucw"8„"n医y m磯u làm tiêu b違n quan sát f逢噂i kính hi吋n vi, 8瓜rj„pi"8衣i 400 l亥n. - Swcp"uƒv"eƒe"8員e"8k吋m:
‚ N医m men n違y ch欝i hay phân c逸t t院 bào.
‚ N院u n医m men n違y ch欝k"vj·"zƒe"8鵜nh v鵜 trí n違y ch欝i (t衣i c詠c hay b医t kì v鵜 trí nào).
3.6.2.3 Quan sát bào t穎
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻k"x q"8 c"rgvtk"e„ ch泳c"o»k"vt逢運ng MT4. Nuôi c医y 荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong kho違ng 5 - 10 ngày.
- Ucw"8„"n o"vk‒w"d違p"uqk"v逢挨k"f逢噂i kính hi吋n vi, 8瓜 rj„pi"8衣i 400 l亥n, r欝i 8瓜 rj„pi"8衣i 1000 l亥n.
25
‚ N医m men có hình thành bào t穎 hay khơng.
‚ N院u có, xƒe"8鵜nh hình d衣ng và s嘘n逢嬰ng bào t穎 n医m men.
3.6.3. Kh違q"uƒv"eƒe"8員c tính sinh lý sinh hóa [7] 3.6.3.1. Chu育n b鵜 gi嘘ng
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào 嘘ng nghi羽m có ch泳c"o»k"vt逢運ng MT4. Ni c医y 荏 nhi羽v"8瓜 phịng trong 48h.
- Ucw" 8„" zƒe" 8鵜nh m壱v" 8瓜 t院 bào b茨pi" rj逢挨pi" rjƒr" 8院m tr詠c ti院p, s穎 d映ng bu欝pi"8院m Thoma lo衣i 1/400 mm2.
3.6.3.2. Kh違p<pi"ej鵜u nhi羽t
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻k"x q"eƒe"8 c"rgvtk"e„"ej泳c"o»k"vt逢運ng MT1.
- Nuôi c医y 荏 các nhi羽v"8瓜 khác nhau: 41, 42, 43, 44, 45oC trong t栄医m. - Quan sát s詠 hình thành khu育n l衣c sau kho違ng 2 - 3 ngày.
3.6.3.3. Kh違p<pi"d鵜 hóa glucose
- Nguyên t逸c: d詠a vào s詠 8鰻i màu c栄a bromthymol blue. Bromthymol blue là ch医t ch雨 th鵜 màu, s胤 e„"o w"x pi"vtqpi"o»k"vt逢運ng acid và màu xanh trong
o»k"vt逢運ng ki隠m. O»k"vt逢運pi"OV7"e„"j o"n逢嬰pi"8逢運pi"ecq"x "j o"n逢嬰ng peptone th医p. Peptone s胤 t衣q"8k隠u ki羽n cho nh英ng gi嘘ng n医m men khơng có kh違p<pi"n‒p"ogp"rjƒv"vtk吋p"8逢嬰c.
- Chu育n b鵜: các 嘘ng nghi羽m có ch泳a 10 on"o»k"vt逢運ng MT5, bromthymol blue,
嘘pi"fwtjco"8«"8逢嬰c ti羽t trùng0"Ejkc"vj pj"4"8k隠u ki羽n thí nghi羽m: y院m khí và hi院u khí.
- C医y gi嘘ng vào các 嘘ng nghi羽m, m壱v"8瓜 t院 bào 106 t院 bào/ml. Các 嘘ng 荏 8k隠u ki羽n y院o"mj "8逢嬰c nh臼 sáp cho kín. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phịng trong 3 ngày.
- Ucw"8„"vk院n hành quan sát:
‚ Kh違 p<pi"n‒p"ogp<"n院u n医m men có kh違 p<pi"n‒p"ogp."嘘ng nghi羽m s胤 có màu vàng trong c違4"8k隠u ki羽n thí nghi羽m. N院u n医m men ch雨 có th吋 hơ h医p hi院w"mj "pj逢pi"mj»pi"n‒p"ogp"8逢嬰c, ch雨 có 嘘ng nghi羽o"vtqpi"8k隠u ki羽n hi院u khí màu vàng.
‚ S詠 t衣q"o pi"vt‒p"o»k"vt逢運ng ni c医y.
26
3.6.3.4. Kh違p<pi"n‒p"ogp"eƒe"nq衣k"8逢運ng
- Nguyên t逸c: d詠a vào s詠 hình thành CO2 荏 8ƒ{"嘘pi"fwtjco"8吋 zƒe"8鵜nh n医m men có kh違p<pi"n‒p"ogp"nq衣k"8逢運ng nào.
- Chu育n b鵜: các 嘘ng nghi羽m có 10 on"o»k"vt逢運ng MT6, ch泳a t瑛ng lo衣k"8逢運ng c亥n kh違o sát, 嘘ng fwtjco" 8«" 8逢嬰c ti羽t trùng. 渦pi" 8嘘i ch泳ng là 嘘ng ch泳a glucose.
- C医y gi嘘ng vào các 嘘ng nghi羽m, m壱v"8瓜 t院 bào 106 t院 bào/ml. Các 嘘pi"8逢嬰c nh臼 sáp cho kín 8吋 t衣q"8k隠u ki羽n y院m khí. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phịng trong 3 ngày. - Ucw"8„"ti院n hành quan sát 12h/l亥n, liên t映c trong 3 ngày:
‚ S詠 xu医t hi羽n b丑t khí.
‚ Chi隠u cao c瓜t khí trong 嘘ng durham.
3.6.3.5. Kh違p<pi"rjƠp"iki nitrate
- Nguyên t逸c: d詠a vào s詠 8鰻i màu c栄a phenol red. Phenol red là ch医t ch雨 th鵜
màu, s胤e„"o w"x pi"vtqpi"o»k"vt逢運pi"cekf"x "o w"8臼vtqpi"o»k"vt逢運ng ki隠m. - Chu育n b鵜: các 嘘ng th衣ch nghiêng khơng b鵜 t衣p nhi宇m, có ch泳a o»k" vt逢運ng
MT7, phenol red, Kali nitrate. 渦pi"8嘘i ch泳ng là 嘘ng ch雨e„"o»k"vt逢運ng MT7. - C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào các 嘘ng nghi羽m. 曳 荏 nhi羽v"8瓜
phòng trong 1 tu亥n.
- Ucw"8„"vk院n hành quan sát. N院u n医m men có th吋 phân gi違k"8逢嬰c nitrate, ion K+ s胤 n o"v<pi"rJ"o»k"vt逢運pi0"Mjk"8„"ej医t ch雨 ch鵜 màu phenol red s胤 làm h欝ng
o»k"vt逢運ng.
3.6.3.6. Kh違p<pi"rjÔp"iki urea
- Nguyên t逸c: d詠a vào s詠 8鰻i màu c栄a phenol red. Phenol red là ch医t ch雨 th鵜
màu, s胤 có o w"x pi"vtqpi"o»k"vt逢運pi"cekf"x "o w"8臼vtqpi"o»k"vt逢運ng ki隠m. - Chu育n b鵜: các 嘘ng th衣ch nghiêng không b鵜 t衣p nhi宇m, có ch泳c" o»k" vt逢運ng
MT7, phenol red, urea. 渦pi"8嘘i ch泳ng là 嘘ng ch雨 e„"o»k"vt逢運ng MT7.
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào các 嘘ng nghi羽m. 曳 荏 nhi羽v"8瓜
phòng trong 1 tu亥n.
- Ucw"8„"vk院n hành quan sát. N院u n医m men có th吋 phân gi違k"8逢嬰c urea, s違n ph育m t衣o thành là CO2 và NH3, chính NH3 s胤 n o"v<pi"rJ"o»k"vt逢運pi0"Mjk"8„"ej医t ch雨 ch鵜 màu phenol red s胤 làm h欝pi"o»k"vt逢運ng.
27
3.6.3.7. Kh違p<pi"rjÔp"iki tinh b瓜t
- Nguyên t逸c: d詠a vào s詠 8鰻i màu c栄a thu嘘c th穎 lugol. Dung d鵜ch lugol có màu vàng, s胤 hóa xanh khi ti院p xúc v噂i tinh b瓜t.
- Chu育n b鵜: các 8 c petri khơng b鵜 t衣p nhi宇m, có ch泳c"o»k"vt逢運ng MT8.
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào các 8 c"rgvtk"e„"ch泳c"o»k"vt逢運ng MT8. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong 1 tu亥n.
- Ucw"8„"nh臼 vài gi丑t thu嘘c th穎 lugol lên các v院t c医y và quan sát. N院u n医m men có th吋 phân gi違k"8逢嬰c tinh b瓜t, dung d鵜ch lugol s胤mj»pi"8鰻i màu.
3.6.3.8. Kh違p<pi"j„c"n臼ng gelatine
- Nguyên t逸e<"igncvkpg"8»pi"8員e"vtqpi"o»k"vt逢運pi"fkpj"f逢叡ng. N院u n医m men có enzyme gelatinase s胤 phân gi違k"igncvkpg"n o"o»k"vt逢運ng hóa l臼ng.
- Chu育n b鵜: các 嘘ng th衣ch nghiêng khơng b鵜 t衣p nhi宇m, có ch泳c" o»k" vt逢運ng MT9.
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào các 嘘ng th衣ch nghiêng có ch泳a
o»k"vt逢運ng MT9. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phịng trong 1 tu亥n.
- Ucw"8„"8員t các 嘘ng th衣ch nghiêng vào t栄 mát kho違ng n穎a gi運 vt逢噂c khi ti院n
hành quan sát.
3.6.3.9. Kh違p<pi"ukpj"vt逢荏pi"vt‒p"o»k"vt逢運ng có 50% glucose
- Chu育n b鵜: các 嘘ng th衣ch nghiêng không b鵜 t衣p nhi宇m, có ch泳c" o»k" vt逢運ng MT10.
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào các 嘘ng th衣ch nghiêng có ch泳a
o»k"vt逢運ng MT10. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong 1 tu亥n. - Ucw"8„"vk院n hành quan sát s詠 hình thành khu育n l衣c.
3.6.3.10. Kh違 p<pi" ukpj" vt逢荏pi" vt‒p" o»k" vt逢運ng có 5% glucose, 10% NaCl
- Chu育n b鵜: các 嘘ng th衣ch nghiêng không b鵜 t衣p nhi宇m, có ch泳c" o»k" vt逢運ng MT11.
- C医y 1 vòng que c医y n医m men 1 ngày tu鰻i vào các 嘘ng th衣ch nghiêng có ch泳a
o»k"vt逢運ng MT11. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phòng trong 1 tu亥n. - Ucw"8„"vk院n hành quan sát s詠 hình thành khu育n l衣c.
28
3.6.4. Kh違o sát ho衣t tính lên men
- Chu育n b鵜: các 嘘ng nghi羽m có ch泳c"42"on"o»k"vt逢運ng MT12
- C医y gi嘘ng vào các 嘘ng nghi羽m, m壱v"8瓜 t院 bào 106 t院 bào/ml. Các 嘘pi"8逢嬰c nh臼uƒr"ejq"m p"8吋 t衣q"8k隠u ki羽n y院m khí. 曳荏 nhi羽v"8瓜 phịng trong 1 tu亥n. - Sau 1 tu亥p"n‒p"ogp."8q"eƒe"ej雨 s嘘: Bx, pH và 8瓜 c欝n.
3.6.5. A鵜nh danh u挨"d瓜 n医m men
- D詠a vào các k院t qu違 thí nghi羽o."zƒe"8鵜nh 8員e"8k吋m hình thái, sinh lý, sinh hóa c栄a các gi嘘ng n医m men phân l壱r"8逢嬰c.
- A鵜pj"fcpj"u挨"d瓜 theo khóa phân lo衣i Lodder & Kreger Ỵ Van Rij.
3.6.6. D詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢運ng
- Ch丑n gi嘘ng n医m men có kh違 p<pi lên men cao nh医t trong các gi嘘ng phân l壱p
8逢嬰c 8吋 d詠pi"8逢運pi"eqpi"ukpj"vt逢荏ng.
- S穎 d映ng erlen lo衣i 250 ml có ch泳c"422"on"o»k"vt逢運ng MT12.
- C医y gi嘘ng vào erlen, m壱v"8瓜 t院 bào 106 t院 bào/ml. 曳 erlen 荏 nhi羽v"8瓜 phòng. - Sau m厩i 2h nuôi c医y, ti院n hành l医y m磯w"zƒe"8鵜nh m壱v"8瓜 t院 bào s嘘ng.
- Pj逢挨pi" rjƒr: 8院m t院 bào tr詠c ti院p, s穎 d映ng bu欝pi" 8院m Thoma lo衣i 1/400 mm2, thu嘘c nhu瓜o"zcpj"ogvj{ngpg"8吋 phân bi羽t t院 bào s嘘ng, ch院t.
3.7. Eƒe"rj逢挨pi"rjƒr"nghiên c泳u
Các thí nghi羽o"8隠w"8逢嬰c l員p l衣i 3 l亥n. 雲 các thí nghi羽m kh違o sát kh違p<pi"n‒p"
men ethanol, các nghi羽m th泳e"8逢嬰e"zƒe"8鵜pj"8瓜Dtkz."rJ"vt逢噂c và sau lên men.
3.7.1. Rj逢挨pi"rjƒr"xác 8鵜nh m壱v"8瓜 t院 bào
- A院m t院 bào tr詠c ti院p: s穎 d映ng bu欝pi"8院m Thoma lo衣i 1/400 mm2
- Pha lỗng m磯w"8院n n欝pi"8瓜 thích h嬰p, sao cho s嘘 t院 bào trong 1 ô vuông nh臼 2
Ỵ 5 t院 bào, s嘘 t院 bào trong 1 ô vuông l噂n 10 Ỵ 50 t院 bào.
- Cho vài gi丑t xanh methylene vào n欝pi"8瓜 pha loãng sau cùng.
- Nh臼 dung d鵜ch vào bu欝pi"8院o."8壱{"ncog"ogp0"A吋{‒p"x k"rj¿v"vt逢噂c mjk"8院m. - S嘘 t院 bào trong 1ml m磯w"dcp"8亥w"8逢嬰e"zƒe"8鵜nh:
軽 = 畦.1000 .繋