Thu mẫu cá nhiễm vi khuẩn
Theo dõi bệnh lý của cá
Thu mẫu cá lờ đờ và cá chết sau đó cân trọng lượng, đo chiều dài từng con. Thu máu để phân tích huyết học và các chỉ tiêu khác.
- Lấy mẫu cá sau 0, 3,6, 12, 24, 48, 96 giờ. - Vớt những cá có dấu hiệu lờđờ hoặc gần chết.
Quan sát và ghi nhận những dấu hiệu cũng như biểu hiện của cá, theo dõi tỉ lệ chết của cá trong suốt quá trình thí nghiệm.
- Lấy mẫu cá sau 0, 3, 6, 12, 24, 48, 96 giờ.
- Thu mẫu kiểm tra các chỉ tiêu huyết học trên những mẫu cá có dấu hiệu lờ đờ, gần chết.
3.4 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu huyết học Hồng cầu Hồng cầu
Cho máu vào ống eppendorf và tiến hành nhuộm mẫu theo phương pháp Natt và Herrick (1952). Cho 10µl máu vào ống nghiệm có chứa 1990 µl dung dịch natt và Herrick lắc nhẹ. Sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ hồng cầu bằng cách chọn 5 vùng đếm lặp lại 2 lần. Mật độ hồng cầu tính theo công thức: HC = C x 10 x 200 (tb/mm3) (Trong đó C: Tổng tế bào hồng cầu ở 5 vùng đếm)
Bạch cầu
Dùng ống tiêm 1ml máu ở mạch máu phần đuôi cá. Cho 1 giọt máu lên lame và trãi đều mẫu, để khô tự nhiên trong không khí. Cốđịnh mẫu bằng methanol. Tiến hành nhuộm mẫu theo phương pháp Humason (1979). Cho lame mẫu vào dung dịch Wright trong 3-5 phút. Chuyển sang dung dịch pH 6.2-6.8 từ 5-6 phút. Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút. Tiếp tục cho mẫu vào dung dịch pH 6.2 từ 15-30 phút. Rửa sạch mẫu bằng nước cất, để khô tự nhiên. Đọc kết quả dưới kính hiển vi.
Phương pháp đo Hematorite
Theo Larsen và Snieszko (1961) (Trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) (Phụ lục 4)
Phương pháp so màu quang phổ
Theo Oser (1965) (trích dẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998) (Phụ lục 4)
Số lượng huyết sắc tố mmol/l (A) = (0,019 + 37,74 a) × 0,621
Trong đó: a là mức độ hấp thu ánh sáng hay số đo được từ máy so màu quang phổ
Số lượng huyết sắc tố g/100ml = A × 1,6125
Các chỉ tiêu huyết học tính tóan theo phương pháp của Weinberg và ctv (1972) (tríchdẫn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1998)
Thể tích hồng cầu (MCV: mean cell volume): Tỷ lệ huyết cầu (%)
MCV ((µm3)= x 10 Số lượng hồng cầu (106/mm3)
Khối lượng trung bình của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCH : mean cell hemoglobin):
Huyết sắc tố (g/dL)
MCH (pg) = x 10
Số lượng hồng cầu (106/mm3)
Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCHC : mean cell hemoglobin concentration):
Huyết sắc tố (g/dL) x 100 MCHC (%) =
Tỷ lệ huyết cầu (%)
3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và phân tích phương sai ANOVA một chiều để tìm ra sự khác biệt giữa các giá trị trung bình nghiệm thức với mức ý nghĩa p<0,05. Sử dụng phần mềm Excel và SPSS 16.0 để xử lý thống kê.
CHƯƠNG 4: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Giá trị LC50 của thuốc trừ sâu Cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin lên cá tra lên cá tra
Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nước tĩnh, các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm được trình bày trong Bảng 1. Cho thấy nhiệt độ buổi chiều cao hơn buổi sáng từ 0,2-0,4oC. pH khá ổn định trong thời gian thí nghiệm 7,12 đến 7,34. Hàm lượng oxi hòa tan nằm trong khoảng 4,69 mg/L ở các nghiệm thức. Hàm lượng oxi hòa tan từ lúc bắt đầu thí nghiệm đến thời điểm cuối thí nghiệm có sự chênh lệch lớn là do suốt quá trình thí nghiệm các bể tiến hành trong điều kiện hoàn toàn không sục khí, cá sử dụng oxi trong quá trình hô hấp làm giảm dần lượng oxi hòa tan trong nước. Tuy nhiên lượng oxi gần như đồng đều giữa các nghiệm thức ở từng thời điểm
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong bể trước khi tiến hành thí nghiệm
Chỉ tiêu Sáng Chiều
pH 7,12±0,10 7,34±0,25
Oxy hòa tan 5,02±0,07 4,69±0,09
Nhiệt Độ 27,2±0,2 27,4±0,7
Giá trị: trung bình ± độ lệch chuẩn.
Các yếu tố môi trường trong thời gian thí nghiệm khá đồng đều và ổn định giữa các nghiệm thức thích hợp cho sự phát triển bình thường của cá. Khi cho thuốc trừ sâu cyrus 25EC vào bể cá thí nghiệm, cá bắt đầu chết nhiều trong 3-9 giờ và số cá chết tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc thí nghiệm từ 0 (đối chứng) đến nồng độ cao nhất là 0,3 mg/L, cá tăng hoạt động hô hấp và giảm hoạt động bơi lội, thời gian hoạt động bơi lội giảm khi nồng độ thuốc gia tăng. Ở nồng độ thuốc cao khi tiếp xúc thuốc sau 1 giờ mang cử động mạnh để tăng cường hô hấp, cá biểu hiện mất thăng bằng, bơi lội không định hướng, giảm bơi lội, sau đó cá chết. Tỷ lệ chết gia tăng theo sự gia tăng nồng độ.
Kết quả thí nghiệm cho thấy giá trị LC50-96h của cypermethrin đối với cá tra khá cao. Giá trị LC50-96 giờ của cypermethrin đối với cá tra của thí nghiệm này là 0,072 mg/L. Một số nghiên cứu khác với hoạt chất cypermethrin cho thấy giá trị LC50-96 giờtrên cá giống Labeo rohita được tìm thấy ở nồng độ 0,139 mg/L (Basanta, 2002), giá trị LC50-24h của họat chất cypermethrin trên cá Cyprinus
carpio là 1,86 ppm (Suvetha, 2010). Tuỳ loại hoạt chất, loài cá khác nhau mà giá trị LC50 khác nhau. Độc tính của thuốc trừ sâu còn tuỳ thuộc vào kích cỡ cá, cá nhỏ chịu đựng kém hơn cá lớn là do hàm lượng lipid trong cơ thể cá lớn cao nên dự trữđược nhiều độc chất hơn (Murty, 1988). Cá hoạt động mạnh sau khi tiếp xúc với cypermethrin làm tăng quá trình trao đổi chất dẫn đến tăng hấp thu chất độc trong cơ thể. Sự tổn thương trê thận cá theo Farombi et al. (2008) thí
nghiệm Butachlor trên cá Clarias gariepinus thì sự giảm hoạt tính men GST ở thận liên quan đến sự dư thừa chất bất hoạt enzyme, chất này tạo liên kết cystine (cysteina β-lyase hoặc chất nền chứa O-) từ chất chuyển hóa glutathion (GSH) và gây độc trên thận. Tuy nhiên, Koesoemadinata và Djajadirecdja (1976) cho rằng độc tính của thuốc BVTV có giá trị LC50<1 mg/L nằm trong nhóm thuốc BVTV có độc tính cao. Giá trị LC50-96 giờ là 0,072mg/L thì cyrus 25EC chứa hoạt chất cypermethrin có độc tính rất cao đối với cá tra giống. Theo Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư (2010) thì các chất độc xuất hiện trong môi trường nước có thể làm tổn thương các tế bào biểu bì mang, làm đông đặc chất nhầy tạo thành một màng bao bọc bề mặt hô hấp, ngăn cản quá trình trao đổi khí giữa cá và nước và cá sẽ chết ngạt. Ngoài ra, các chất độc cũng có thể làm tổn thương cơ quan hô hấp phụ như da, cơ quan trên mang và ruột.
4.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Cyrus chứa hoạt chất cypermethrin lên chỉ tiêu huyết học chỉ tiêu huyết học
4.2.1 Số lượng hồng cầu
Bảng 4.1. Số lượng hồng cầu (106 tế bào/mm3) của cá trong quá trình thí nghiệm với cypermethrin Nghiệm thức Thời Gian Thu Mẫu Đối chứng 0,036 mg/L (cypermethrin) 0,072 mg/L (cypermethrin) 0h 2,22±0,15a 2,07±0,14a 2,15±0,11a 3h 1,90±0,05a 1,45±0,11b 1,54±0,03b 6h 1,86±0,13ab 1,94±0,11a 1,53±0,05b 9h 1,96±0,05a 2,07±0,06a 1,77±0,07ab 12h 2,09±0,07a 1,78±0,03b 1,47±0,04c 24h 1,93±0,11a 1,99±0,07a 1,35±0,05c 48h 1,82±0,02a 1,44±0,01bc 1,47±0,06bc 72h 1,90±0,19a 1,71±0,13ab 1,57±0,02b 96h 1,99±0,09a 1,78±0,05ab 1,69±0,04ab
Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Kết quả thí nghiệm cho thấy số lượng hồng cầu của cá tra có xu hướng giảm so với đối chứng sau khi tiếp xúc với cypermethrin. Sau 3h cá tiếp xúc thuốc tổng lượng hồng cầu của cả 2 nghiệm thức đều giảm so với đối chứng, ở nồng độ 0,072 mg/L giảm từ 2,15 triệu tế bào/mm3 xuống 1,54 triệu tế bào/mm3 (giảm 28,37%) và 0,036 mg/L giảm từ 2,073 triệu tế bào/mm3 xuống 1,453 triệu tế bào/mm3 (giảm 29,90%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Số lượng hồng cầu ở nghiệm thức 0,072 mg/L và 0,036 mg/L cho thấy sau khi cá tiếp xúc thuốc cyrus có xu hướng tăng nhẹ ở 6h và 9h nhưng khác biệt không có ý nghĩa so với đối chứng. Ở thời điểm 12h sau khi cá tiếp xúc thuốc số lượng Hồng cầu cả 2 nghiệm thức giảm so với đối chứng, ở nồng độ thuốc 0,072 mg/L giảm từ 2,09 triệu tế bào/mm3 xuống 1,473 triệu tế bào/mm3 (giảm 29,52%) và 0,036 mg/L giảm từ 2,09 triệu tế bào/mm3 xuống 1,783 triệu tế bào/mm3 (giảm 14,68%), khác biệt có ý nghĩa (p<0,05). Nghiệm thức 0,072 mg/L cho ta thấy số lượng hồng cầu giảm khác biệt có ý nghĩa ở các thời điểm so với đối chứng (p<0,05). Hiện tượng giảm tế bào hồng cầu có khả năng do cypermethrin làm ức chế cơ quan tạo và tổng hợp hồng cầu, gia tăng phá hủy hồng cầu trong cơ quan tạo máu. Đến 96 giờ cả hai nghiệm thức ở nồng độ 0,072 mg/L và 0,036 mg/L tổng lượng hồng cầu tăng nhẹ nhưng vẫn thấp hơn và không khác biệt so với đối chứng.
Kết quả này cũng tương tự như một số nghiên cứu khác cùng hoạt chất cypermethrin trên cá rohita số lượng hồng cầu giảm có ý nghĩa so với đối chứng ở nồng độ thuốc 0,16µg/L, 0,4µg/L và 0,8 µg/L sau khi tiếp xúc thuốc trong suốt quá trình thí nghiệm (Adhikari et al. , 2004). Sự thay đổi tổng lượng hồng cầu của cả 2 nghiệm thức cá rohita nhiễm cypermethrin trong 45 ngày cho thấy giảm so với đối chứng nhưng khác biệt không có ý nghĩa (p>0,05) (Das, 2003).
Tuy nhiên theo Hii và ctv (2007) nghiên cứu trên lươn đồng khi tiếp xúc với endosulfan hồng cầu tăng sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ, nhưng thời điểm 96 giờ hồng cầu lại giảm so với đối chứng. Sau khi tiếp xúc với diazinon (2 mg/L, 4 mg/L, 8 mg/L, 16 mg/L, 32 mg/L) số lượng hồng cầu giảm thấp và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng ở thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ trên cá da trơn giống (Koprucu et al, 2006). Khi cá tiếp xúc với thuốc diazinon thì mang của cá sẽ bị hoại tử hay lớp màng nhầy của mang bị cô đặc lại làm ảnh hưởng đến quá trình hô hấp của cá, cá sẽ phản ứng lại thông qua gia tăng số lượng hồng
cầu bằng cách huy động lượng máu từ kho dự trữ hoặc tăng nhanh quá trình tạo máu (Đỗ Thị Thanh Hương, 2010).
Cá tiếp xúc với nồng độ thuốc cao, thuốc thâm nhập vào máu hồng cầu bị phá vỡ làm cho số lượng hồng cầu trong cơ thể giảm thấp và có hiện tượng nhân hồng cầu phân thùy hay phân hủy cũng xuất hiện trên lame. Những biểu hiện bất thường ở hồng cầu như trên cũng được Vosyliene & Svecevìeius (1997) mô tả như là biểu hiện bệnh lý của cá nhiễm độc kim loại. Tế bào hồng cầu được tạo ra từ mô của tụy hoặc tì tạng, khi cá tiếp xúc thuốc ở nồng độ cao cơ quan tạo hồng cầu bị phá vỡ ảnh hưởng đến quá trình tạo hồng cầu trong máu (Morgan et al.,
1980 trích dẫn Koprucu et al., 2006).
4.2.2 Số lượng bạch cầu
Bảng 4.2: Số lượng bạch cầu (104 tế bào/mm3) trong quá trình thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin Nghiệm thức Thời Gian Thu Mẫu Đối chứng 0,036 mg/L (cypermethrin) 0,072 mg/L (cypermethrin) 0h 18,40±1,43a 18,23±1,65a 17,64±1,02a 3h 15,32±0,33a 12,40±0,95b 12,30±0,90b 6h 14,57±2,22a 11,56±0,77b 11,06±1,04b 9h 15,47±0,93a 12,73±1,34b 12,58±0,53ab 12h 15,26±1,49a 15,04±0,42a 11,19±0,44b 24h 15,37±1,44a 13,72±0,30b 11,27±0,43bc 48h 14,32±1,44a 11,74±0,08b 12,83±1,00ab 72h 14,37±0,52a 13,43±0,38ab 12,00±0,67ab 96h 13,87±1,37ab 13,52±0,60a 12,83±0,37ab
Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Sau 3 giờ, bạch cầu của cá ở nghiệm thức đều bị giảm, nghiệm thức ở nồng độ 0,072 mg/L giảm từ 18,23 nghìn tế bào/mm3 xuống 12,40 nghìn tế bào/mm3 (giảm 31,98%) và nghiệm thức ở nồng độ 0,036 mg/L giảm từ 17,64 nghìn tế bào/mm3 xuống 12,30 nghìn tế bào/mm3 (giảm 30,27%) đồng thời cũng giảm khác biệt có ý nghĩa so với số lượng bạch cầu của cá ở lô đối chứng. Cá tiếp xúc thuốc Cyrus sau 6h tổng lượng bạch cầu vẫn giảm so với ban đầu và so với đối chứng, nghiệm thức cá tiếp xúc thuốc ở nồng độ 0,072 mg/L giảm 20,65% và nghiệm thức ở nồng độ 0,036 giảm 24,09% so với đối chứng tại cùng thời điểm 6 giờ. Sau 12 và 24 giờ số lượng bạch cầu của cá ở nghiệm thức 0,072 mg/L vẫn còn giảm và sai khác có ý nghĩa. Sau 96 giờ lượng bạch cầu ở 2 nồng độ 0,072
mg/L và 0,036 mg/L có tăng nhưng vẫn thấp hơn so với đối chứng. Khi thuốc thâm nhập vào cơ thể ở nồng độ cao, bạch cầu bị phá hủy bởi thuốc và các cơ quan sản sinh bạch cầu bị ảnh hưởng cao bởi thuốc làm số lượng bạch cầu của cá giảm (Morgan et al. , 1980 trích dẫn Koprucu et al. , 2006). Sau 3 ngày các cơ quan trong cơ thể cá dần dần phục hồi nhằm giúp cơ thể thoát khỏi tình trạng “stress” sinh lý ở các nghiệm thức và không còn khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng.
Sự thay đổi số lượng bạch cầu là phản ứng của cơ thể nhằm thích nghi với điều kiện bất lợi của môi trường sống. Nhiều nghiên cứu trước cũng cho thấy sự thay đổi số lượng bạch cầu khi cá tiếp xúc thuốc trừ sâu (Hii et al., 2007; Koprucu et al., 2006; Khoshbavar-Rostami et al, 2006). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2.3 Hàm lượng huyết sắc tố (Hemoglobin, mmol/l)
Bảng 4.3: Hàm lượng huyết sắc tố (mmol/l) của cá trong quá trình thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin Nghiệm Thức Thời Gian Thu Mẫu Đối chứng 0,036 mg/L (cypermethrin) 0,0372 mg/L (cypermethrin) 0h 9,35±0,24a 9,72±0,79a 9,21±0,36a 3h 10,75±0,18a 9,66±0,52ab 8,86±0,24c 6h 9,97±1,29a 7,48±1,11b 7,54±0,42c 9h 8,74±0,34b 9,00±0,91a 7,81±0,10bc 12h 9,78±0,28a 7,20±0,37b 7,19±0,86b 24h 9,68±0,16a 6,44±0,60c 6,83±1,20c 48h 7,95±0,54a 5,18±0,54c 5,31±0,41c 72h 9,69±0,55a 5,24±0,36c 5,66±0,27c 96h 8,95±0,7a 6,22±1,10b 5,23±0,34bc
Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Hàm lượng hemoglobin của cá có xu hướng giảm dần sau khi cá tiếp xúc cypermethrin. Sau khi tiếp xúc thuốc 6 giờ, hàm lượng hemoglobin của cá ở cả 2 nghiệm thức giảm đáng kể, nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,072 giảm từ 9,97 mmol/L xuống 7,54 mmol/L (giảm 24,93%) và nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,036 mg/L giảm từ 9,97 mmol/L xuống 7,48 mmol/L (giảm 24,33%) so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so (p<0,05). Sau 48 giờ, hàm lượng hemoglobin của cá ở cả 2 nghiệm thức giảm đáng kể, nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,072 giảm từ 7,95 mmol/L xuống 5,31 mmol/L (giảm 34,80%) và nghiệm thức có nồng độ thuốc 0,036 mg/L giảm từ 7,95 mmol/L
xuống 5,18 mmol/L (giảm 33,21%) so với nghiệm thức đối chứng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so (p<0,05). Nhìn chung hàm lượng huyết sắc tố cá cá nhiễm cypermethrin có xu hướng giảm trong suốt thời gian thí nghiệm.
Nghiên cứu sự nhiễm độc cypermethrin trên cá tra đã đem lại kết quả là làm giảm tế bào hồng cầu, hemoglobin và gây ra hiện tượng thiếu máu. Hàm lượng hemoglobin giảm ảnh hưởng đến khả năng vận chuyển oxy trong máu. Kết quả này tương tự như kết quả của (Koprucu et al, 2006) khi cho cá tiếp xúc với diazinon hemoglobin giảm khi nồng độ thuốc gia tăng. Adhikari et al. (2004)
nghiên cứu trên loài cá xương, khi cá tiếp xúc với cypermethrin và carbofuran hàm lượng huyết sắc tố trong máu giảm mạnh khi nồng độ thuốc gia tăng. Cá tra tiếp xúc với malachite green hàm lượng huyết sắc tố cũng giảm (Lương Thị Diễm Trang, 2009).
4.2.4 Tỷ lệ huyết cầu (%)
Bảng 4.4 Tỷ lệ huyết cầu (%) của cá trong quá trình thí nghiệm cá nhiễm cypermethrin Nghiệm thức Thời gian thu mẫu Đối chứng 0,036 mg/L (cypermethrin) 0,072 mg/L (cypermethrin) 0h 38,77±3,34a 36,23±0,83a 37,90±3,11a 3h 44,83±7,40a 40,27±5.77ab 43,57±1,94a 6h 50,19±6,71a 29,80±4,86c 33,38±2,36b 9h 48,51±3,08a 43,51±4,00ab 36,13±2,27bc 12h 39,07±0,61a 39,54±3,66a 37,46±6,21ab 24h 36,60±4,54a 38,10±1,93a 28,61±3,14c 48h 37,01±0,47a 27,12±2,70b 28,67±2,50b 72h 32,51±3,97b 35,65±3,99a 30,34±3,64bc 96h 34,18±1,74a 24,28±3,69c 28,36±1,66b
Các giá trị cùng hàng theo sau cùng chữ cái (a, b, c) thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Số liệu trình bày: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.
Sự biến động tỷ lệ huyết cầu của cá sau khi tiếp xúc cypermethrin được trình bày ở bảng dưới đây. Kết quả cho thấy sau khi tiếp xúc thuốc 3 giờ tỷ lệ huyết cầu có xu hướng tăng nhẹở nghiệm thức 0,072 mg/L tăng 11,15% từ 37,9% tỉ lệ huyết cầu lên 43,57% tỉ lệ huyết cầu và ở nghiệm thức có nồng độ 0,036 mg/L tăng 14,96% từ 36,23% tỉ lệ huyết cầu lên 40,27% tỉ lệ huyết cầu nhưng không