3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu
3.2.2. Điều tra các loại cây dược liệu được dùng điều trị bệnh gan
Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp phỏng vấn người dân địa phương cĩ nhiều kinh nghiệm, kiến thức về sử dụng cây thuốc điều trị các bệnh về gan như: các lương y ở các nhà thuốc nam, những người đi thu hái thuốc nam, các thầy cho thuốc nam ở các chùa theo mẫu Phiếu điều tra cây thuốc trong cộng đồng (Viện Dược liệu, Bộ Y tế) (Phụ lục 3). Từ đĩ, thống kê lại theo họ và lập danh sách về các lồi cây làm thuốc
thường được dùng để điều trị bệnh gan theo họ. Kết quả điều tra làm cơ sở để chọn họ thực vật nghiên cứu.
Các địa điểm được chọn điều tra là nơi chuyên sử dụng các loại cây dược liệu trong điều trị bệnh, 3 địa điểm được chọn gồm: (1) Hội Đơng y Thị xã Bình Minh (số 150, tổ 1, khĩm 5, Phường Thành Phước, Thị xã Bình Minh, Vĩnh Long); (2) Đền thờ Nguyễn Trung Trực (đường Nguyễn Cơng Trứ, phường Vĩnh Thanh, thành phố Rạch Giá, tỉnh Kiên Giang); (3) Chùa Tịnh Độ (Khĩm 2, Thị trấn Tri Tơn, tỉnh An Giang).
3.2.3 Thu mẫu và chiết cao một số cây thuộc họ Cà phê
Dựa vào kết quả điều tra cây dược liệu sử dụng điều trị bệnh gan được thực hiện ở mục 3.2.2, nghiên cứu đã chọn họ Cà phê thu mẫu các bộ phận một số cây gồm Trang to (lá, hoa), Mơ lơng (lá), Mơ leo (lá), Gáo trắng (rễ, thân, lá), Gáo vàng (rễ, thân, lá), Lưỡi rắn (cả cây), và Lưỡi rắn trắng (cả cây).
Để khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa và bảo vệ gan của các loại thực vật nghiên cứu, các bộ phận từ các cây được chọn thu mẫu được chiết cao methanol. Mẫu thực vật sau khi thu về được rửa sạch, loại bỏ những phần bị sâu bệnh, nấm mốc, vàng héo, úa dập, để ráo nước rồi đem phơi khơ ở nhiệt độ phịng. Sau đĩ, mẫu thực vật khơ được đem xay nhuyễn thành mẫu bột nguyên liệu cĩ kích thước hạt khoảng 60 mesh. Bột nguyên liệu được cho vào trong túi vải và chiết trong methanol bằng phương pháp ngâm. Mẫu (2000 g) được ngâm 3 lần trong methanol (5 lít/ lần), mỗi lần ngâm khoảng 48 giờ, dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại, cơ quay đuổi dung mơi thu được cao methanol tổng. Hiệu suất chiết cao được xác định theo cơng thức:
3.2.4 Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
Pha dung dịch cao chiết: Mỗi loại cao chiết được cân 0,1 gram cho vào 1000 µL methanol, khuấy cho cao chiết tan hồn tồn trong dung dịch, tiến hành ly tâm mẫu 3000 vịng/ phút trong 5 phút để loại bỏ phần cặn. Đây là các dung dịch cao chiết dùng cho các thí nghiệm hoặc để pha lỗng thành các các dung dịch cĩ nồng độ khác nhau tùy theo phương pháp thử nghiệm.
3.2.4.1 Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết
Định tính thành phần hĩa học của các cao chiết
Các cao chiết đã được kiểm tra định tính về sự hiện diện của các thành phần hĩa học như alkaloid, flavonoid, steroid, glycoside, saponin và tanin theo mơ tả của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007).
Phương pháp định lượng polyphenol tổng
Tổng hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp so màu Folin- Ciocalteu (Singleton et al., 1999). Phản ứng gồm 250 µL cao chiết; 250 µL nước khử ion và 250 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu (25%). Sau 8 phút, 250 µL dung dịch sodium carbonate 10% đã được thêm vào và lắc đều. Sau khi ủ 30 phút ở 40oC, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 765 nm. Hàm lượng polyphenol được xác định tương đương miligam gallic acid trên mỗi gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết).
Phương pháp định lượng flavonoid tổng
Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo quy trình được mơ tả bởi Sultana
et al. (2009) cĩ hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 200 µL cao chiết; 200 µL nước khử ion và 200 µL NaNO2 5% được ủ trong 5 phút. Sau đĩ, hỗn hợp được thêm vào 40 µL AlCl3 (10%) và ủ trong 6 phút. Tiếp theo, thêm 400 µL NaOH 1M. Thể tích cuối cùng được điều chỉnh thành 1000 µL bằng nước khử ion và trộn kỹ. Sau 15 phút, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sĩng 510 nm. Hàm lượng flavonoid được xác định tương đương miligam quercetin trên mỗi gram cao chiết (mg QE/g cao chiết).
Phương pháp định lượng alkaloid tổng
Hàm lượng alkaloid được xác định bằng phương pháp hình thành phức hợp với bromocresol green (BCG), tạo thành sản phẩm cĩ màu vàng (Shamsa et al., 2008). Cao chiết (1 mL) cho phản ứng với 1 mL dung dịch HCl 2N. Sau khi phản ứng 5 phút thì dung dịch trên được lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn. Cho dung dịch trên vào bình tách chiết lần lượt thêm vào 5 mL BCG và 5 mL dung dịch đệm phosphate (pH 4,7). Cuối cùng, hỗn hợp được lắc mạnh bằng bình tách chiết với 10 mL dung dịch chloroform, sau 2 phút phản ứng ở nhiệt độ phịng, tiến hành đo độ hấp thụ quang phổ bước sĩng 470 nm. Hàm lượng alkaloid (mg AE/g cao chiết) trong các dịch ngoại bào được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn atropine.
3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
Khảo sát hiệu quả trung hịa gốc tự do DPPH
Các cao chiết được khảo sát hiệu quả kháng oxy hĩa theo cơ chế trung hịa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Thử nghiệm DPPH được thực hiện theo phương pháp của Shekhar and Anju (2014) cĩ hiệu chỉnh như sau: Cao chiết được pha lỗng ở các nồng độ khác nhau (10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL) gồm 200 µL được phản ứng với 200 µL DPPH (6×10-4 M). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối, ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 60 phút. Sau đĩ, hỗn hợp được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 517 nm. Vitamin C được sử dụng làm đối chứng dương và khảo sát hiệu quả trung hịa gốc tự do DPPH ở các nồng độ 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 và 40
µg/mL. Thử nghiệm khảo sát hoạt tính trung hịa gốc tự do DPPH được thực hiện lặp lại 3 lần/ nồng độ và lấy giá trị trung bình. Hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH của cao chiết và vitamin C được xác định dựa vào cơng thức:
Trong đĩ: Ac (A control) là giá trị độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm (methanol); As (A sample) là giá trị độ hấp thu quang phổ của dung dịch mẫu thử
Ngồi ra, hiệu quả kháng oxy hĩa của các cao chiết và vitamin C cịn được xác định dựa vào nồng độ mà tại đĩ cao chiết hay vitamin C trung hịa được 50% lượng gốc tự do DPPH (Effective concentration of 50%, EC50). Giá trị EC50 được tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH.
Khảo sát khả năng khử của các cao chiết
Dung dịch cao chiết được pha lỗng thành các nồng độ: 100, 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/mL. Đồng thời, butylated hydroxyanisole (BHA) cũng được pha theo dãy nồng độ sau: 0, 10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL để làm đối chứng dương.
Khả năng khử của các cao chiết và BHA được thực hiện theo phương pháp của Oyaizu (1986) cĩ hiệu chỉnh như sau: 0,5 mL dung dịch cao chiết hoặc BHA theo các nồng độ đã pha và 0,5 mL đệm phosphate (0,2 M, pH=6,6) tiếp tục thêm vào 0,5 mL K3Fe(CN)6 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong 20 phút. Sau đĩ, hổn hợp được thêm tiếp 0,5 mL CCl3COOH 10% rồi ly tâm 3000 vịng/ phút trong 10 phút. Dịch ly tâm được rút 0,5 mL, thêm vào 0,5 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều. Tiến hành đo độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng ở bước sĩng 700 nm. Khả năng khử của các cao chiết được xác định dựa vào hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA và nồng độ cao chiết khử được 50% gốc tự do (EC50).
Khảo sát hiệu quả kháng oxy hĩa tổng
Khả năng kháng oxy hố tổng (Total antioxidant capacity-TAC) của các cao chiết được đánh giá bằng phương pháp phosphomolybdenum của Prieto et al. (1999). Phương pháp này dùng đánh giá cả chất kháng oxy hĩa hịa tan trong nước và chất kháng oxy hĩa hịa tan trong dầu (Aliyu et al., 2013). Hỗn hợp phản ứng gồm 0,3 mL cao chiết kết hợp với 3 mL dung dịch thử (0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodium phosphate và 4 mM ammonium molybdate). Hổn hợp phản ứng được ủ ở 95oC trong 90 phút. Sau khi ủ, hỗn hợp phản ứng được làm mát ở nhiệt độ phịng và tiến hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 695 nm. Methanol (0,3 mL) thay cho cao chiết được sử dụng làm đối chứng âm. Khả năng kháng oxy hố tổng của các cao chiết thể hiện bằng hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương µg/mL trolox và EC50.
3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết
Các cao chiết cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa sẽ được khảo sát hoạt tính kháng viêm
in vitro. Khả năng kháng viêm của cao chiết được khảo sát thơng qua hoạt động ức chế sự biến tính protein được thực hiện theo phương pháp của Shah et al. (2017) cĩ hiệu chỉnh. Dung dịch thử 1 mL (ở các nồng độ khác nhau) được trộn với 1 ml dung dịch BSA 5%. Sau đĩ, hỗn hợp được ủ ở 27oC trong 15 phút. Sự biến tính protein được tạo ra bằng cách giữ hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong 10 phút. Sau khi làm mát, tiến hành đo mật độ quang tại bước sĩng 660 nm. Thuốc kháng viêm diclofenac được sử dụng như chất đối chứng dương. Khả năng ức chế sự biến tính protein của các cao chiết được xác định theo cơng thức sau: % Ức chế = 100 (1-Vt/Vc). Trong đĩ, Vt: giá trị mật độ quang của mẫu thử, Vc: giá trị mật độ quang của mẫu đối chứng khơng cĩ cao chiết.
3.2.5 Khảo sát hiệu quả bảo vệ gan của cao chiết trên mơ hình chuột
Nghiên cứu sử dụng mơ hình in vivo gây tổn thương gan chuột với tác nhân carbon tetrachloride (CCl4) với các ưu điểm gồm cơ chế gây độc gan được biết rõ, các biến đổi trên động vật về mơ học và huyết học tương tự như trên người.
3.2.5.1 Khảo sát khả năng làm giảm enzyme AST và ALT
Các cao chiết cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa và kháng viêm được tiến hành khảo sát hiệu quả bảo vệ gan trên mơ hình chuột theo mơ tả của Kang and Koppula (2014) cĩ hiệu chỉnh. Chuột được gây tổn thương gan bằng CCl4 liều 2,5 mL/kg khối lượng chuột (20% CCl4 trong dầu olive). Cao chiết được thử nghiệm ở các liều 100, 200 hoặc 400 mg/kg khối lượng chuột (Singhal and Gupta, 2012; Meharie et al., 2020). Tinh chất silymarin liều 16 mg/kg được sử dụng như thuốc bảo vệ gan đối chứng (Duong et al, 2016). Dimethyl sulfoxide (DMSO) 1% được dùng pha cao chiết và silymarin.
Chuột đực khỏe mạnh gồm 155 con cĩ khối lượng dao động từ 22 đến 25 g được chia thành 31 nhĩm, mỗi nhĩm gồm cĩ 5 con chuột. Trong đĩ, thử nghiệm gồm cĩ 4 nhĩm đối chứng và 27 nhĩm sử dụng cao chiết lần lượt ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg khối lượng chuột. Chuột được cân khối lượng và bố trí vào các nhĩm thí nghiệm, chuột được uống thuốc vào buổi sáng (8-9 giờ) mỗi ngày, sau 1 giờ chuột uống CCl4 sẽ được uống cao chiết hoặc silymarin với liều tương ứng mơ tả ở trên 1 lần/ ngày. Thí nghiệm được thực hiện trong thời gian 4 tuần. Các nhĩm chuột được bố trí thí nghiệm trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm bảo vệ gan của các cao chiết trên mơ hình chuột
Nhĩm Nội dung khảo sát
1 Chuột bình thường uống nước cất (đối chứng sinh lý) 2 Chuột bình thường uống dầu olive DMSO 1%
3 Chuột uống CCl4, (đối chứng bệnh) 4 Chuột uống CCl4, silymarin liều 16 mg/kg 5 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ lơng liều 100 mg/kg 6 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ lơng liều 200 mg/kg 7 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ lơng liều 400 mg/kg 8 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ leo liều 100 mg/kg 9 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ leo liều 200 mg/kg 10 Chuột uống CCl4, cao lá Mơ leo liều 400 mg/kg 11 Chuột uống CCl4, cao lá Trang to liều 100 mg/kg 12 Chuột uống CCl4, cao lá Trang to liều 200 mg/kg 13 Chuột uống CCl4, cao lá Trang to liều 400 mg/kg 14 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo trắng liều 100 mg/kg 15 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo trắng liều 200 mg/kg 16 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo trắng liều 400 mg/kg 17 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo trắng liều 100 mg/kg 18 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo trắng liều 200 mg/kg 19 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo trắng liều 400 mg/kg 20 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo trắng 100 mg/kg 21 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo trắng 200 mg/kg 22 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo trắng 400 mg/kg 23 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo vàng 100 mg/kg 24 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo vàng 200 mg/kg 25 Chuột uống CCl4, cao lá Gáo vàng 400 mg/kg 26 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo vàng 100 mg/kg 27 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo vàng 200 mg/kg 28 Chuột uống CCl4, cao rễ Gáo vàng 400 mg/kg 29 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo vàng 100 mg/kg 30 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo vàng 200 mg/kg 31 Chuột uống CCl4, cao vỏ thân Gáo vàng 400 mg/kg
Sau thời gian 4 tuần, các nhĩm chuột được cân khối lượng, gây mê và giải phẫu lấy máu ở tim gởi đi xét nghiệm hàm lượng enzyme alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) bằng máy xét nghiệm sinh hĩa bán tự động Erba CHEM-7 (Phịng xét nghiệm 144, Đường Nguyễn An Ninh, Phường Tân An, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ).
Gan chuột ở các nghiệm thức được tách lấy quan sát và chụp ảnh. Sau đĩ gan được chia làm 2 phần, một phần để phân tích khả năng ức chế sự peroxide hĩa lipid
(thử nghiệm MDA) và điều hịa hoạt động kháng oxy hĩa (thử nghiệm GSH) trong gan chuột, phần cịn lại được cố định trong formol để thực hiện tiêu bản mơ bệnh học.
3.2.5.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hĩa in vivo của các cao chiết
Định lượng malonyldialdehyd và glutathione
Tiến hành định lượng malonyldialdehyde (MDA) và glutathione (GSH) theo phương pháp của Ohkawa et al. (1979) và Moron et al. (1979) được hiệu chỉnh theo Nguyễn Bảo Trân và ctv (2011). Gan chuột được tách ra và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15% ở nhiệt độ 4oC. Dịch đồng thể gan (1 mL) được trộn với 0,5 mL dung dịch đệm phosphate 25 mM (pH = 7,4) và ủ ở 37oC trong 60 phút. Phản ứng sau khi được kết thúc bằng 0,5 mL acid tricloacetic 10% được ly tâm 13000 vịng/ phút trong 10 phút ở 4°C. Phần dịch lỏng sau khi ly tâm được sử dụng để xác định hàm lượng MDA và GSH.
Hàm lượng malonyldialdehyde (MDA) được xác định như sau: Lấy 1 mL dịch ly tâm cho phản ứng với 0,5 mL acid thiobarbituric 0,8% ở 100oC trong 30 phút và đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/g) được xác định dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA.
Hàm lượng glutathione (GSH) được xác định như sau: 1 mL dịch ly tâm được phản ứng với 0,2 mL thuốc thử Ellman và 1,8 mL dung dịch đệm EDTA-phosphate. Hỗn hợp phản ứng được để yên 3 phút ở nhiệt độ phịng và sau đĩ tiến hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/g) được xác định dựa theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH.
3.2.5.3 Khảo sát khả năng bảo vệ mơ gan của các cao chiết
Thực hiện tiêu bản mơ bệnh học gan chuột
Tiêu bản mơ học gan chuột thí nghiệm được thực hiện dựa theo qui trình được mơ tả bởi Saalu et al. (2012) cĩ hiệu chỉnh. Gan ở các nhĩm chuột sau khi tách lấy được cố định trong dung dịch formol 2% và 4%. Các mẫu gan đã cố định ở các nhĩm chuột thí nghiệm được rửa với nước và được khử nước ở các nồng độ cồn 50o, 70o, 80o, 90o, 96o. Các mẫu gan tiếp tục được ngâm trong xylen, paraffin, sáp ong (ủ trong 24 giờ) và đúc khuơn trong parafin. Sau đĩ, các mẫu gan được cắt thành lát cĩ độ dày khoảng 5 µm, dán mẫu lên lame đã tráng glycerin trộn với lịng trắng trứng và để khơ tự nhiên. Nhuộm mẫu với hematoxylin 10%, eosin Y 0,1% và mẫu được làm trong bởi xylen. Tiêu bản được đậy và dán với Baume Canada. Tiêu bản mơ bệnh học gan chuột sẽ được quan sát dưới kính hiển vi quang học để phân tích đánh giá mức độ tổn thương và phục hồi của mơ gan.