b. Thuyết minh quy trình
3.6.8.Thử nghiệm phân giải hemoglobin
Khả năng phân giải hồng cầu được quyết định theo Promdonkoy và Ellar (2003). Theo đó, tiến hành pha lỗng dịch huyền phù khơng có tế bào B. cereus và bổ sung tế bào hồng cầu người trong PBS. Dịch này được ủ ở 370C và tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm ở các thời điểm khác nhau. Ảnh hưởng của kefiran
được thử nghiệm ở các nồng độ 0, 500, 800 và 1000 mg/l. Phần trăm hồng cầu khơng bị ly giải được tính theo cơng thức % = (A600 mẫu/A600 đối chứng)x100. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 600 nm
3.6.9. Kết quả
Sử dụng dịch huyền phù được thử nghiệm trên tế bào Caco-2 dẫn đến đáp ứng theo liều được chỉ định. Hình 3.10A, hoạt tính sinh học bao gồm tổng sự tách rời tế bào khi nồng độ các yếu tố ngoại bào cao. Khơng có sự tách rời khi ủ với mơi trường BHI hoặc BHI và kefiran. Từ đó nhận thấy rằng kefiran (800 mg/l) có khả năng bảo vệ tế bào hồng cầu khỏi hoạt tính tách rời của dịch huyền phù B. cereus.
Hình 3.10B chứng tỏ rằng ảnh hưởng của các nồng độ kefiran khác nhau đến hoạt tính sinh học của các yếu tố ngoại bào B. cereus được pha loãng 1/32. Sự bảo vệ chống lại các hoạt tính sinh học của dịch chiết tương đương với nồng độ kefiran từ 300-1000 mg/l. Thật ra chỉ có 55% tế bào duy trì sự gắn kết khi khơng có kefiran trong khi giá trị này khoảng 80% khi thử nghiệm tất cả các nồng độ của kefiran.
Hình 3.10: Ảnh hưởng của dịch huyền phù B. cereus đối với tế bào biểu bì ruột ở người (Caco – 2)
Ảnh hưởng sinh học của các yếu tố ngoại bào B. cereus bao gồm sự suy yếu của hoạt tính dehydrogenase ty thể (hình 3.11). Kefiran cũng bảo vệ chống lại hoạt tính phá hủy tế bào. Thật ra, độ pha lỗng dịch huyền phù ni cấy sử dụng B. cereus
ở nồng độ 1/16 duy trì 50% hoạt tính dehydrogenase ty thể trong khi đến 70% hoạt tính được duy trì khi có sự hiện diện của kefiran.
Hình 3.11: Ảnh hưởng của việc sử dụng dịch huyền phù B. cereus B10502 đến hoạt tính dehydrogenase ty thể trên tế bào Caco-2 khi có và khơng có sự hiên diện của kefiran
Tế bào đơn bào Caco – 2 được ủ 1 h với dịch huyền phù B. cereus có tỷ lệ
hoại tử cao (hình 3.12A). Trái lại, khi có sự hiện diện của kefiran trong khi ủ, ảnh hưởng hoại tử giảm đi đáng kể và chỉ có một vài tế bào tự hủy (hình 3.12B,C). Nghiên cứu sử dụng kính hiển vi điện tử để quan sát. Bề mặt tế bào hấp thu ở ruột bị thay đổi đáng kể khi ủ với dịch huyền phù B. cereus gồm có sự mất đi và ngắn bớt các lơng nhỏ (hình 3.13A). Trái lại, với sự hiện diện của kefiran được duy trì giống như thực nghiệm đối chứng (hình 3.13B,C).
Hình 3.12: Đánh giá số lượng tế bào hoại tử và tự chết bằng cách đánh dấu với Annexin V – FITC và propiduin Iodine
Kết quả hoạt tính thủy phân hồng cầu của dịch huyền phù có liên quan đến tính độc tế bào. Q trình thủy phân này thể hiện khi có sự hiện diện hay khơng có sự hiện diện của kefiran được thể hiện ở hình 3.14. Độ pha lỗng dịch huyền phù ni cấy có B. cereus cao (1/192) có sự ly giải hồng cầu ở người. Hoạt tính ly giải hầu như biến mất khi bổ sung kefiran ở nồng độ 800 mg/l.
Hình 3.13: Kết quả quét dưới kính vi điện tử của tế bào Caco – 2 khi ủ với dịch huyền phù B. cereus khi có (A), khơng có (B) kefiran, (C) đối chứng
Hình 3.14: Kết quả ly giải tế bào hồng cầu ở người theo thời gian của dịch nuôi cấy