Nhận xột: Khi pH tăng từ 3,50 đến 6,50 thỡ Ip tăng và đạt cực đại tại pH = 6,20 nhưng pic khụng trơn, cú pic lạ; tiếp tục tăng lờn pH = 6,50 thỡ Ip giảm chõn pic khụng cõn đối. Từ kết quả trờn chỳng tụi lựa chọn
pH = 4,60 làm điều kiện cho quỏ trỡnh phõn tớch .
III.1.3. Cỏc điều kiện tối ưu để xỏc định hoạt chṍt metrodinazole
Từ kết quả trờn chỳng tụi đó tỡm được cỏc thụng số đo và cỏc điều kiện tối ưu để xỏc định hoạt chất metronidazole trong viờn nang thuốc do cỏc Cụng ty dược sản xuất như sau:
Bảng 3.6. Cỏc thụng số của mỏy đo tối ưu
1 Điện cực làm việc HMDE 7 Thời gian làm giàu 0s
2 Chế độ đo DP 8 Thời gian cõn bằng 10s
3 Kớch thước giọt 4 9 Biờn độ xung 0,05V
4 Tốc độ khuấy 2000 10 Thời gian đặt một xung 0,05s 5 Thời gian đuổi oxi 90s 11 Tốc độ quột thế 0,025V/s 6 Thế điện phõn làm giàu 0 12 Khoảng quột thế 0V ữ -0,5V
- Điều kiện mụi trường làm việc: + Nền điện li đệm photphat + pH của mụi trường: pH = 4,60.
Khảo sỏt tớnh thớch hợp của hệ thống cực phổ bằng cỏch sử dụng dung dịch chuẩn (cú nồng độ chớnh xỏc biết trước), tiến hành đo lặp lại 6 lần ở cựng 1 nồng độ của 1 dung dịch chuẩn. Tớnh thớch hợp của hệ thống cực phổ được biểu thị qua độ phõn giải của pic, sai số tương đối của 6 phộp thử song song đối với thế bỏn súng (đại lượng cú giỏ trị định tớnh), Chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn (đại lượng cú giỏ trị định lượng).
Cỏch tiến hành:
- Chuẩn bị 6 cốc cú dung tớch 25 ml và cú vạch chia thể tớch và 6 bỡnh định mức dung tớch 25 ml. Dựng pipột lấy chớnh xỏc cho vào tất cả 6 cốc mỗi cốc 2ml dung dịch chứa metrodinazole 0,02 mg/ml. Thờm vào tất cả cỏc cốc (giống nhau): 5ml dung dịch đệm (phothat), pH= 4,60, thờm nước cất hai lần đến vạch 25 ml, đem từng hỗn hợp dung dịch đi kiểm tra pH xem cú thay đổi khụng (nếu cú thay đổi phải chỉnh lại), sau đú lấy từng cốc chuyển toàn bộ hỗn hợp dung dịch vào từng bỡnh định mức 25ml, thờm nước cất hai lần tới vạch định mức, lắc kỹ cho đều được dung dịch metrodinazole 0,0016 mg/ml. - Đo cực phổ: đem 6 dung dịch đó chuẩn bị đo xỏc định chiều cao Ip và E1/2. Đặt chế độ đo và cỏc thụng số tối ưu đó xỏc định, đo lặp nhiều lần và xỏc định giỏ trị trung bỡnh. Tớnh giỏ trị trung bỡnh (E1/2 và Ip), độ lệch chuẩn (S) và độ lệch chuẩn ttương đối(RSD %) bằng chương trỡnh toỏn học thống kờ đó được lập trỡnh sẵn bằng ngụn ngữ lập trỡnh Turbo-Pascal . Kết quả khảo sỏt tớnh thớch hợp của hệ thống cực phổ đa năng 757VA Computrace được trỡnh bày ở hỡnh 3.6. và bảng 3.7
0 -100m -200m -300m -400m -500m -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hỡnh 3.6. Cực phổ đồ của mẫu số 1 dung dịch chuẩn metrodinazole
Bảng 3.7. Kết quả tớnh thớch hợp của hệ thống cực phổ đa năng 757VA Computrace đối với chất chuẩn metrodinazole
STT Thế bỏn súng (-E1/2= -Ep )
-Ip.10-8A của dung dịch metrodinazole 0,0016 mg/ml 1 0,3162 2,333 2 0,3186 2,318 3 0,3159 2,323 4 0,3144 2,317 5 0,3171 2,378 6 0,3184 2,357 Giỏ trị trung bỡnh 0,31677 + 0,00168 2,3377 + 0,02592 Độ lệch chuẩn S 0,0016 0,0247 45
RSD(%) 0,50% 1,06%
Nhận xột: Hỡnh 3.6 là kết quả 3 lần đo lặp của mẫu chuẩn metrodinazole 0,02mg/ml, ta thấy 3 đường cực phổ tương đối trựng nhau, vậy độ lặp của phộp đo tốt .
từ kết quả bảng 3.7 trờn ta thấy độ lệch chuẩn tương đối về thế bỏn súng (E1/2) , thế ứng với đỉnh pic (Ep) của đường cong cực phổ xung vi phõn cỡ 0,50%,
về chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn (Ip) của dung dịch metrodinazole 1,06% đều khỏ nhỏ. Chứng tỏ việc phõn tớch chất chuẩn metrodinazole của hệ thống cực phổ đa năng 757VA Computrace đạt yờu cầu về tớnh thớch hợp.
III.1.5. Nghiờn cứu độ lặp lại của kết qủa đo trong phương phỏp cực phổ xung vi phõn
Phõn tớch ở 3 mức nồng độ. Ở mỗi mức nồng độ đo 8 lần, khảo sỏt độ lặp lại của chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn (Ip). éỏnh giỏ độ phõn tỏn của số liệu dựa vào giỏ trị độ lệch chuẩn (S) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD %) theo cụng thức (2.8).
Cỏch tiến hành: Chuẩn bị dung dịch chuẩn Metrodinazole ở cỏc nồng độ : 0,00025 mg/ml; 0,0045 mg/ml; 0,0075 mg/ml đem đo lặp 8 lần. Tớnh giỏ trị trung bỡnh (Ip), độ lệch chuẩn (S) và độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của Ip bằng chương trỡnh toỏn học thống kờ đó được lập sẵn bằng ngụn ngữ lập trỡnh Pascal thu được kết quả được thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả xỏc định độ lặp của phương phỏp phỏp cực phổ xung vi phõn khi định lượng metrodinazole.
Nồng độ thực (mg/ml) Số lần đo lặp lại (8) Thấp:0,00025 Trung bỡnh:0,0045 Cao: 0,0075 Chiều cao dũng khuếch tỏn xung vi phõn
1 0,331 5,775 8,516 2 0,328 5,837 8,713 3 0,342 5,912 8,812 4 0,346 5,948 8,681 5 0,335 5,829 8,726 6 0,331 5,962 8,475 7 0,344 5,943 8,684 8 0,330 5,957 8,671 Giỏ trị trung bỡnh (Ip) 0,336 5,895 8,659 éộ lệch chuẩn S 0,00708 0,07157 0,111 éộ lệch giỏ trị trung bỡnh 0,0025 0,0253 0,0393
Sai số tương đối q% 1,766 1,017 1,075
éộ lệch chuẩn tương đối RSD(%) 2,1 1,21 1,28
Kết quả thu được cho thấy ở 3 giỏ trị nồng độ khảo sỏt RSD% đối với chiều cao dũng khuếch tỏn xung vi phõn (Ip) của metrodinazole < 3,5%, chứng tỏ phương phỏp cú độ lặp lại tốt giữa cỏc lần xỏc định chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn (Ip) của chuẩn metrodinazole (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
III.1.6. Phương phỏp đường chuẩn và phương phỏp thờm chuẩn xỏc định hoạt chṍt C6H9N3O3 trong thuốc metrodinazole
III.1.6.1. Xõy dựng đường chuẩn tỡm khoảng nồng độ metrodinazole tối ưu
Dựa trờn kết quả thu được từ tớn hiệu điện húa và xử lớ số liệu chỳng tụi xõy dưng được đồ thị phụ thuộc tuyến tớnh giữa Ip và Cmetrodinazole chuẩn. Sau đú chuẩn bị dung dịch mẫu ỏp vào đường chuẩn và xỏc định ra Cx
a.Cỏch tiến hành
Pha thang chuẩn: Dựng pipột lấy chớnh xỏc 0,25; 0,50; 2,00; 3,00; 5,00; 6,00; 8,00; 9,00; 10,00 và 10,25ml dung dịch chứa metrodinazole 0,02 mg/ml cho vào 10 cốc cú dung tớch 25ml và cú vạch chia thể tớch, thờm 5ml dung dịch đệm (photphat), pH= 4,60; thờm nước cất hai lần gần đến vạch 25ml, kiểm tra pH (nếu pH thay đổi phải chỉnh lại), chuyển 10 cốc dung dịch vào 10 bỡnh định mức 25 ml, thờm nước cất hai lần tới vạch định mức, lắc kỹ cho đều dung dịch.
Pha dung dịch nghiờn cứu: Dựng pipột lấy chớnh xỏc 2ml dung dịch nghiờn cứu chứa hoạt chất metrodinazole Cx cho vào cốc cú dung tớch 25ml, thờm 5ml dung dịch đệm photphat (pH= 4,60), thờm nước cất hai lần gần đến vạch 25 ml, kiểm tra pH dung dịch (nếu pH thay đổi phải chỉnh lại), chuyển toàn bộ hỗn hợp dung dịch vào bỡnh định mức 25 ml, thờm nước cất tới vạch định mức, lắc kỹ cho đều dung dịch.
Đo cực phổ: Sau khi đó chuẩn bị xong dung dịch đem đo và thu được kết quả Ip, Ci ghi bảng 3.9 . Xử lý thống kờ theo phương phỏp bỡnh phương tối thiểu trờn phần mềm Excel được thể hiện trờn hỡnh 3.7 và 3.8
0 -100m -200m -300m -400m -500m -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hỡnh 3.7. Phổ đồ cực phổ xung vi phõn thể hiện sự phụ thuộc Ipic vào Ci dung dịch chuẩn metrodinazole.
0,0024mg/ml 0,0064 mg/ml 8.10-4 mg/ml 0,0072 mg/ml 0,004mg/m 48
Bảng 3.9. Sự phụ thuộc nồng độ của metrodinazole vào chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn
STT Cmetro (mg/ml) - Ipic.10-8(A)
1 0,0002 0,41 2 0,0004 0,68 3 0,0016 2,37 4 0,0024 3,62 5 0,0040 5,82 6 0,0048 6,48 7 0,0064 8,54 8 0,0072 9,76 9 0,0080 10,78 10 0,0082 11.21
Hỡnh 3.8. Sự phụ thuộc nồng độ của metrodinazole vào chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn
Sau khi xử lý thống kờ trờn phần mềm Turbo-pascal đó được lập
trỡnh sẵn thu được phương trỡnh đường chuẩn như sau:
Ipic = (1324,299 ±38,5034) Cmetro + 0,2007 (3.1)
Hệ số tương quan R2 = 0,9987
Nhận xột: nồng độ của metrodinazole biến thiờn trong khoảng (0,0002→ 0,0082) mg/ml cú sự tương quan tuyến tớnh với chiều cao dũng khuếch tỏn
giới hạn xung vi phõn tương ứng, thể hiện qua đường thẳng hồi qui và hệ số tương quan R2 = 0,9987. Hệ số tương quan R2 ≈ 1, cho thấy hầu hết cỏc giỏ trị đo được nằm trờn đường hồi qui hoặc phõn bố đều cả hai phớa của đường hồi qui. Trờn cơ sở đú, chỳng tụi đó tỡm được khoảng nồng độ tối ưu khi định lượng metrodinazole trong thuốc từ 0,0002 mg/ml đến 0,0082 mg/ml .
b.Giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng metrodinazole
Để xỏc định giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng chỳng tụi pha dung dịch metrodinazole 0,0002mg/ml (nồng độ nhỏ nhất của thang chuẩn) đo 20 lần ở cỏc điều kiện như khi đo dung dịch của đường chuẩn chấp nhận sự sai khỏc gữa độ lệch chuẩn của dung dịch đo và độ lệch chuẩn của mẫu trắng là khụng đỏng kể kết quả sử lý thống kờ trờn phần mềm Turbo-Pascal ghi trong bảng 3.10
Bảng 3.10. Kết quả đo được Ip dũng cực phổ xung vi phõn hấp phụ
STT: X[i] : (X[i]-Xtb) 1 : 4.10000000E-01 : 9.75000000E-03 2 : 4.50000000E-01 : 4.97500000E-02 3 : 4.30000000E-01 : 2.97500000E-02 4 : 4.15000000E-01 : 1.47500000E-02 5 : 4.25000000E-01 : 2.47500000E-02 6 : 4.30000000E-01 : 2.97500000E-02 7 : 4.45000000E-01 : 4.47500000E-02 8 : 4.60000000E-01 : 5.97500000E-02 9 : 4.75000000E-01 : 7.47500000E-02 10 : 4.55000000E-01 : 5.47500000E-02 STT: X[i] : (X[i]-Xtb) 11 : 3.25000000E-01 : -7.52500000E-02 12 : 3.30000000E-01 : -7.02500000E-02 13 : 3.45000000E-01 : -5.52500000E-02 14 : 3.50000000E-01 : -5.02500000E-02 15 : 3.60000000E-01 : -4.02500000E-02 16 : 3.75000000E-01 : -2.52500000E-02 17 : 3.80000000E-01 : -2.02500000E-02 18 : 3.55000000E-01 : -4.52500000E-02 19 : 3.90000000E-01 : -1.02500000E-02 20 : 4.00000000E-01 : -2.50000000E-04
Giỏ trị trung bỡnh của X = 4,0025.10-1 ± 2,1529.10-2
- Tớnh:
- Giới hạn phỏt hiện:
2 2 4 x ro 1 5 3.S . 3.4,6068.10 .0,0002 3.4,6068.10 .2.10 D= 0,4 4.10 6,9102.10 0,00007 / met C LO X mg ml − − − − − = = = =
-Giới hạn định lượng:
2 2 4 x ro 1 5 10.S . 10.4,6068.10 .0,0002 10.4,6068.10 .2.10 = 0,4 4.10 23,034.10 0,00023 / met C LOQ X mg ml − − − − − = = = = (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả tốt giới hạn phỏt hiện: 0,00007 mg/ml < 0,0002mg/ml (nồng độ nhỏ nhất của đường chuẩn)
c- Kiểm tra đường chuẩn metrodinazole
éể kiểm tra độ chớnh xỏc của đường chuẩn xõy dựng được, chỳng tụi tiến hành pha dung dịch chuẩn metrodinazole ở ba nồng độ như sau :
+ Dựng pipet lấy 1ml dung dịch chuẩn metrodinazole và 5ml dung dịch đệm photphat pH=4,60 vào bỡnh định mức 25ml, thờm nước cất 2 lần tới vạch định mức được dung dịch metrodinazole cú nồng độ 0,0008mg/ml điều chỉnh pH dung dịch đạt giỏ trị pH=4,60, chuyển dung dịch vào bỡnh điện phõn. Đặt cỏc trị đo ở điều kiện tối ưu đó khảo sỏt.
+ Dựng pipet lấy 3ml dung dịch chuẩn metrodinazole 0,02mg/ml và 5ml dung dịch đệm photphat pH=4,60 vào bỡnh định mức 25ml, thờm nước cất 2 lần tới vạch định mức 25ml được dung dịch metrodinazole cú nồng độ 0,0024mg/ml điều chỉnh pH dung dịch đạt giỏ trị pH=4,60, chuyển dung dịch vào bỡnh điện phõn. Đặt cỏc trị đo ở điều kiện tối ưu đó khảo sỏt.
+ Dựng pipet lấy 8ml dung dịch chuẩn metrodinazole 0,02mg/ml và 5ml dung dịch đệm photphat pH=4,60 vào bỡnh định mức 25ml, thờm nước
cất 2 lần tới vạch định mức được dung dịch metrodinazole cú nồng độ 0,0064mg/ml điều chỉnh pH dung dịch đạt giỏ trị pH=4,60, chuyển dung dịch vào bỡnh điện phõn. Đặt cỏc trị đo ở điều kiện tối ưu đó khảo sỏt.
Cho mỏy cực phổ đa năng 757VA Computrace chạy, vẽ đường cong cực phổ xung vi phõn lần lượt từng dung dịch ở cỏc điều kiện tối ưu. éo lặp lại 8 lần với cỏc dung dịch chuẩn metrodinazole trờn thiết bị cực phổ đa năng 757VA Computrace, ghi kết quả chiều cao dũng khuếch tỏn giới hạn xung vi phõn (Ip). Thay chiều cao (Ip) vào phương trỡnh đường chuẩn (3.1) và tớnh được nồng độ metrodinazole Cx :
C1 = = = 0,000793 mg/ml C2 = = = 0,00238 mg/ml C3 = = = 0,00639 mg/ml
So sỏnh Cx đó tỡm được theo đường chuẩn (3.1) với giỏ trị nồng độ metrodinazole tớnh toỏn theo lý thuyết pha vào mẫu tự tạo với độ thống kờ cho trước để kiểm tra độ chớnh xỏc của đường chuẩn theo chương trỡnh xử lý thống kờ đó được lập trỡnh bằng ngụn ngữ lập trỡnh Turbo-Pascal,thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra độ chớnh xỏc của đường chuẩn khi xỏc định metrodinazole trong mẫu tự tạo (mẫu giả)
Nồng độ thực (mg/ml)
Số lần đo lặp lại (n)
0,0008 0,0024 0,0064
Nồng độ xỏc định được (mg/ml) theo đường chuẩn 1 0,000779 0,002326 0,006318 2 0,000794 0,002349 0,006416 3 0,000756 0,002395 0,006432 4 0,000807 0,002415 0,006422 5 0,000791 0,002337 0,006396 6 0,000762 0,002435 0,006382 7 0,000808 0,002441 0,006407
8 0,000789 0,002329 0,006381
Giỏ trị trung bỡnh 0,000786 0,00238 0,00639
éộ lệch chuẩn S 0,000019 0,000048 0,000036
éộ lệch giỏ trị trung bỡnh 0,0000067 0,000017 0,000013
Sai số tương đối q% 2,034 1,71 0,47
%Sai số tương đối giữa lý thuyết và thực nghiệm
1,814 0,91 0,09
éộ lệch chuẩn tương đối RSD(%) 2,42 2,01 0,56
Hằng số Student thực nghiệm 2,11 1,26 0,45
Hằng số student lý thuyết 2,37 2,37 2,37
Nhận xột: từ bảng 3.11 ta thấy xỏc định metrodinazole trong mẫu tự tạo (mẫu giả) với 3 nồng độ cho kết quả chớnh xỏc và ổn định. Giới hạn tin cậy của phộp đo tại 3 nồng độ: 0,0008mg/ml; 0,0024mg/ml và 0,0064mg/ml tương ứng, giới hạn tin cậy ± 0,02 ; ± 0,08; ±0,04 và theo chuẩn thống kờ (Student thực nghiệm: 2,11; 1,26; 0,45) của 3 nồng độ này đều nhỏ hơn giỏ trị tra bảng (lý thuyết) 2,37 với độ tin cậy 95%, bậc tự do là 8) chứng tỏ rằng cỏc kết quả xỏc định nồng độ metrodinazole bằng phương phỏp cực phổ xung vi phõn khụng mắc sai số hệ thống.
éộ chớnh xỏc của đường chuẩn được đỏnh giỏ qua giỏ trị độ lệch chuẩn S và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%). Kết quả thu được cho thấy RSD% < 2,5% , chứng tỏ đường chuẩn cú độ chớnh xỏc cao giữa cỏc lần phõn tớch, xỏc định. Ta nhận thấy rất đỳng quy luật phõn tớch khi xỏc định nồng độ thấp (0,0008mg/ml) mắc sai số lớn (2,42%) và nồng độ lớn (0,0064mg/ml) mắc sai số ớt (0,56%) và độ lệch chuẩn tương đối, hằng số Student thực nghiệm cũng tuõn theo quy luật này.
Như vậy cú thể sử dụng đường chuẩn này để xỏc định hàm lượng metrodinazole trong cỏc loại thuốc khỏng sinh do cỏc Cụng ty dược khỏc nhau sản xuất.
Nhằm kiểm tra độ chớnh xỏc khi xỏc định metrodinazole bằng phương phỏp đường chuẩn, chỳng tụi tiến hành xỏc định metrodinazole bằng
phương phỏp thờm chuẩn để lấy kết quả so sỏnh với đường chuẩn, đồng thời đa dạng hoỏ cỏc phương phỏp xỏc định hoạt chất metrodinazole cú trong thuốc khỏng sinh của cỏc Cụng ty dược khỏc nhau sản xuất và bỏn trờn thị trường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cỏch tiến hành: Chuẩn bị 4 bỡnh dịnh mức 25ml, dung dịch đệm photphat (pH=4,6), mẫu thuốc metrodinazole, dung dịch chuẩn metrodinazole (0,02mg/ml)
Bỡnh 1: 3ml dung dịch mẫu thuốc (Cx) + 5ml dung dịch đệm, kiểm tra pH, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch 25ml
Bỡnh 2: 3ml dung dịch mẫu thuốc (Cx) + 1ml metrodinazole (0,02 mg/ml) + 5ml dung dịch đệm, kiểm tra pH, định mức bằng nước cất hai lần
Bỡnh 3: 3ml dung dịch mẫu thuốc (Cx) + 2ml metrodinazole (0,02mg/ml) + 5ml dung dịch đệm; kiểm tra pH, định mức bằng nước cất 2 lần
Bỡnh 4: 3ml dung dịch mẫu thuốc (Cx) + 3ml metrodinazole (0,02 mg/ml) + 5ml dung dịch đệm , kiểm tra pH, định mức bằng nước cất hai lần
Đo cực phổ: Đem dung dịch đó chuẩn bị đi do thu được cỏc kết quả và xử lý thống kờ theo phương phỏp bỡnh phương tối thiểu trờn phần mềm Excel được thể hiện trờn bảng 3.12 và hỡnh 3.9, 3.10.
0 -100m -200m -300m -400m -500m -200n -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hỡnh 3.9. phổ đồ cực phổ xung vi phõn Ip phụ thuộc vào Ci thờm chuẩn metrodinazole
+) Đường 1 : peak của 3ml dd mẫu metrodinazole
+) Đường 2 : peak của 3ml dd mẫu + 1ml dd chuẩn metrodinazole +) Đường 3 : peak của 3ml dd mẫu + 2ml dd chuẩn metrodinazole +) Đường 4: peak của 3ml dd mẫu + 3ml dd chuẩn .metrodinazole +) Đường 5: peak của 3ml dd mẫu + 4ml dd chuẩn .metrodinazole